ცილებისა და ცილოვანი კომპლექსების მასობრივი სპექტრომეტრიული იდენტიფიკაცია ატომური ძალის მიკროსკოპის ჩიპებზე ანა ლეონიდოვნა კაიშევა. ცილების ფიზიოქიმიური თვისებები. ცილის გამწმენდი და იდენტიფიკაციის მეთოდები ცილის იდენტიფიკაციის მეთოდები

სათაური

ცილების გამოყოფა და გაწმენდა ხდება ეტაპობრივად.

1. ჰომოგენიზაცია- ეს არის ბიოქიმიური კვლევის ობიექტების საფუძვლიანი დაფქვა ერთგვაროვან, ანუ ერთგვაროვან მდგომარეობამდე, ანუ ცილები განიცდიან საფუძვლიან დაშლას უჯრედის კედლის განადგურებამდე.
ამ შემთხვევაში, ისინი იყენებენ:
მაგრამ)დანის ჰომოგენიზატორები, როგორიცაა Warring;
ბ)პისტოლეტის ჰომოგენიზატორები პოტერი - ელვეგეიმა;
ში)ბურთი და როლიკებით ქარხნები - უფრო მკვრივი ობიექტებისთვის;
ზ)გაყინვისა და გალღობის ალტერნატიული მეთოდი, ხოლო უჯრედის კედლის რღვევა ხდება ყინულის კრისტალების მოქმედების ქვეშ;
ე)"აზოტის ბომბის" მეთოდი - მაღალი წნევის ქვეშ, უჯრედები გაჯერებულია აზოტით, შემდეგ წნევა მკვეთრად ეცემა, გამოიყოფა აირისებრი აზოტი, რომელიც, თითქოსდა, აფეთქებს უჯრედს შიგნიდან;
ე)ულტრაბგერა, პრესის სხვადასხვა მეთოდი, უჯრედის კედლების მონელება ფერმენტებით. უმეტეს შემთხვევაში, სითბო წარმოიქმნება ჰომოგენიზაციის დროს, ხოლო ბევრი ცილის ინაქტივაცია შესაძლებელია, ამიტომ ყველა პროცედურა ტარდება ცივ ოთახებში 0 ° C ტემპერატურაზე ან ნედლეული გაცივდება ყინულით. ამავდროულად, უჯრედების განადგურების მოცულობა და დრო, სამუშაო წნევა საგულდაგულოდ კონტროლდება. იდეალური არის ჰომოგენიზებული პროდუქტი, რომელსაც შეუძლია გაიაროს შემდგომი მოპოვება.

2. ცილების მოპოვება, ანუ დაშლილ მდგომარეობაში მათი თარგმნა; ყველაზე ხშირად, მოპოვება ხორციელდება დაფქვასთან ერთად.

მოპოვება ხორციელდება:
მაგრამ)მარილის 8-10% ხსნარში დაშლა;
ბ)ბუფერული ხსნარების გამოყენებით pH მჟავედან ოდნავ ტუტემდე (ბორატი, ფოსფატი, ციტრატი, ტრის - ბუფერი: ტრიზამინომეტანის ნარევი NH2 - CH3 + HCl;
ში)ცილების ნალექი ორგანული გამხსნელებით (ეთანოლი, მეთანოლი, ბუტანოლი, აცეტონი და მათი კომბინაციები), ხოლო ცილა-ლიპიდური და ცილა-ცილის კომპონენტები დეგრადირებულია, ანუ ChSB- ის განადგურება.

3. ცილების გაწმენდა და ფრაქცია.მოპოვების შემდეგ, ნარევი გამოყოფილია ან დაყოფილია ცალკეულ ცილებად და მათი შემდგომი გაწმენდა:

ა) დამარილებაარის ცილების ნალექის პროცესი ტუტე და ტუტე დედამიწის ლითონების ნეიტრალური მარილის ხსნარებით.

დამარილების მექანიზმი- დამატებული ანიონები და კატიონები ანადგურებს ცილების ჰიდრატირებულ ცილის გარსს, რაც ცილის ხსნარების სტაბილურობის ერთ -ერთი ფაქტორია. Na და ამონიუმის სულფატების ყველაზე ხშირად გამოყენებული ხსნარები. ბევრი ცილა განსხვავდება ჰიდრატაციის გარსის ზომით და მუხტის სიდიდით. თითოეულ პროტეინს აქვს საკუთარი დამარილების ზონა. დამარილებული აგენტის მოცილების შემდეგ ცილა ინარჩუნებს თავის ბიოლოგიურ აქტივობას და ფიზიკოქიმიურ თვისებებს. კლინიკურ პრაქტიკაში დამარილების მეთოდი გამოიყენება გლობულინების გამოყოფისთვის (როდესაც ამონიუმის სულფატის 50% -იანი ხსნარი (NH 4) 2SO 4 ემატება, წარმოიქმნება ნალექი) და ალბუმინი (როდესაც ამონიუმის სულფატის 100% ხსნარი (NH 4) ემატება 2SO 4, წარმოიქმნება ნალექი).

მარილიანობის ღირებულება გავლენას ახდენს:
1) მარილის ბუნება და კონცენტრაცია;
2) pH- გარემო;
3) ტემპერატურა.

ამ შემთხვევაში, იონების ვალენტობა მთავარ როლს ასრულებს. ამრიგად, მარილის მოქმედება შეფასებულია μ ხსნარის იონური სიძლიერით:

, ანუ ხსნარის იონური სიძლიერე (μ) უდრის the თითოეული იონის (C) კონცენტრაციის პროდუქტს მისი ვალენტობის კვადრატში (V).

კონის მეთოდი არის დამარილების ტიპი. კომპონენტების მოპოვება და ნალექი ხდება ერთდროულად. თანმიმდევრულად იცვლება ტემპერატურა (ჩვეულებრივ დაბალი t o –0 + 8 o C), ხსნარის pH და კონცენტრირებული ეთანოლი, ცილის 18 – მდე ფრაქცია თანმიმდევრულად იზოლირებულია სისხლის პლაზმიდან.

კონის მეთოდიგამოიყენება ფარმაცევტულ წარმოებაში სისხლის შემცვლელების წარმოებისათვის;
ბ) ქრომატოგრაფიული მეთოდები... რუსი მეცნიერი მიხაილ ცვეტი (1903) ითვლება ანალიზის ქრომატოგრაფიული მეთოდების განვითარების ფუძემდებლად. ამჟამად, მისი მრავალი სახეობა არსებობს. მეთოდი ემყარება ნივთიერებების უნარს სპეციალურად შეიწოვოს სვეტში ჩასმული ან გადამტანზე მოთავსებული ადსორბენტზე. ამ შემთხვევაში, ანალიზები გამოყოფილია და კონცენტრირებულია მკაცრად განსაზღვრულ ადსორბენტულ ფენაში. შემდეგ, შესაბამისი გამხსნელი (გამხსნელები) გადის სვეტში, რომლებიც ასუსტებს ადსორბციის ძალებს და გარეცხავს ადსორბირებულ ნივთიერებებს სვეტიდან. ნივთიერებები გროვდება ფრაქციის კოლექტორში.

ქრომატოგრაფიაში ფუნდამენტურია განაწილების კოეფიციენტი, რაც ტოლია ნივთიერების კონცენტრაციის თანაფარდობაში მობილური ფაზანივთიერების კონცენტრაციამდე სტაციონარული ფაზა(ან სტაციონარული ფაზა).

სტაციონარული სტაციონარული ფაზა- შეიძლება იყოს მყარი ან თხევადი, ან ნარევი მყარი და თხევადი.

მობილური ფაზა- თხევადი ან აირისებრი, ის მიედინება სტაციონარულად, ან გადის მასში.

სტაციონალური და მობილური ფაზის ტიპებიდან გამომდინარე, არსებობს ქრომატოგრაფიული ანალიზის სხვადასხვა მოდიფიკაცია.

ადსორბცია- დაფუძნებულია ცილების ადსორბენტის სხვადასხვა ხარისხზე და მათ ხსნადობაზე შესაბამის გამხსნელებში.

გამოყენებული ადსორბენტები - სილიციუმის მჟავა, Al 2 O 3, CaCO 3, MgO, ნახშირი. შეწოვის სახით გამხსნელი ადსორბენტი (ჩვეულებრივ ბუფერული ხსნარით) შეფუთულია სვეტში (შუშის ვერტიკალური მილი). ნიმუში გამოიყენება სვეტზე, შემდეგ გამხსნელი ან გამხსნელების ნარევი გადის მასში.

დაყოფა ემყარება იმ ფაქტს, რომ ნივთიერებები უფრო მაღალი K განაწილებით. (ბ) სვეტის გასწვრივ გადაადგილება უფრო დიდი სიჩქარით. წილადების შეგროვება ხორციელდება წილადის შემგროვებლის გამოყენებით.

დანაყოფის ქრომატოგრაფია- დაფუძნებულია ცილების ნარევის ორ თხევად ფაზას შორის განაწილებაზე. გამოყოფა შეიძლება მოხდეს სპეციალურ ქრომატოგრაფიულ ქაღალდზე, ასევე სვეტებში, როგორც ადსორბციის ქაღალდზე. მყარი ფაზა ამ შემთხვევაში ემსახურება მხოლოდ როგორც მხარდაჭერა თხევადი სტაციონარული ფაზისთვის. ქრომატოგრაფიული ქაღალდიაქვს თვისება შეინარჩუნოს წყალი მის ცელულოზის ბოჭკოებს შორის. ეს წყალი სტაციონარული სტაციონარული ფაზაა. როდესაც უწყლო გამხსნელი (მობილური ფაზა) მოძრაობს ქაღალდზე კაპილარული ძალების მოქმედებით, ქაღალდზე გამოყენებული ნივთიერების მოლეკულები განაწილებულია ორ ფაზას შორის მათი განაწილების კოეფიციენტის შესაბამისად. რაც უფრო მაღალია ნივთიერების ხსნადობა მობილურ ფაზაში, მით უფრო მეტად გადაინაცვლებს იგი ქაღალდის გასწვრივ გამხსნელთან ერთად.
სვეტზე ქრომატოგრაფიის განაწილების შემთხვევაში, მატარებლები არიან ცელულოზა, სახამებელი, სილიციუმის გელი და ა.შ., სტაციონარული ფაზა არის წყალი. როდესაც გამოიყენება სვეტზე, ნარევები მოძრაობენ სვეტის გასწვრივ სხვადასხვა სიჩქარით, კრასპრის გათვალისწინებით.

Rf არის მუდმივი თითოეული ნაერთისათვის სტანდარტულ პირობებში.
იონის გაცვლის ქრომატოგრაფია - ემყარება საპირისპიროდ დამუხტული ნაწილაკების მოზიდვას. ამისათვის გამოიყენება სხვადასხვა იონური გაცვლის ფისები: კატიონგადამცვლელი ფისები - შეიცავს უარყოფითად დამუხტულ ჯგუფებს - სულფონირებული სტირენები და CMC, რომლებიც იზიდავს შესწავლილი ნივთიერებების დადებითად დამუხტულ იონებს. მათ ასევე უწოდებენ მჟავა იონის გადამცვლელს.
ანიონის გაცვლის ფისები, ან ძირითადი იონური გადამცვლელი, შეიცავს დადებითად დამუხტულ ჯგუფებს, რომლებიც იზიდავს უარყოფითად დამუხტულ ცილის მოლეკულებს
ტრიმეთილამინოსტიროლი არის სტირენებისა და ცელულოზის წარმოებული.
გამოსაყოფი ცილების q- დან გამომდინარე, გამოიყენება შესაბამისი იონის გადამცვლელი, რომელთანაც გარკვეული ცილები ურთიერთქმედებენ, ზოგი კი თავისუფლად ტოვებს სვეტს. სვეტზე "დალექილი" ცილები ამოღებულია უფრო კონცენტრირებული მარილიანი ხსნარების გამოყენებით ან გამხსნელის pH- ის შეცვლით.
მიახლოებითი ქრომატოგრაფია (ან მიახლოებითი ქრომატოგრაფია) ემყარება ცილების ან სხვა მაკრომოლეკულების სელექციური ურთიერთქმედების პრინციპს მატარებლებზე იმობილიზებულ სპეციფიკურ ნივთიერებებთან - ლიგანდები (ეს შეიძლება იყოს კოენზიმი, თუ ფერმენტი იზოლირებულია, ანტისხეული, ანტიგენი და ა. ერთი ცილა ნარევიდან გარეცხილია ბუფერული ნარევებით შეცვლილი pH ან შეცვლილი იონური სიძლიერე.
უპირატესობა არის მაღალი სიწმინდის მოცემული ნივთიერების იზოლირების უნარი ერთ საფეხურზე.
გელის ფილტრაცია ან მოლეკულური საცრის მეთოდი არის გამტარი ქრომატოგრაფიის ტიპი.
მოლეკულების განცალკევება ზომისა და ფორმის მიხედვით ემყარება მოლეკულური საცრის თვისებებს, რაც აქვს ბევრ ფოროვან მასალას, მაგალითად ორგანულ პოლიმერებს სამგანზომილებიანი ქსელის სტრუქტურით, რაც მათ აძლევს გელის თვისებებს. გელის ფილტრაცია არის ნივთიერებების გამოყოფა გელების გამოყენებით მოლეკულური ზომის განსხვავებებზე დაყრდნობით (სეფაროზა, სეფადექსი, სეფაკრილი, ბიოგელები და ა. ეპიქლოროჰიდრინის მოქმედებით, დექსტრანის პოლისაქარიდული ჯაჭვები (სინთეზირებულია მიკროორგანიზმებით) გადაჯაჭვულია ქსელის სტრუქტურაში, წყალში ხსნადი ხდება, მაგრამ ინარჩუნებს მის დიდ მიდრეკილებას. ამ ჰიდროფილიურობის გამო, შედეგად მიღებული მარცვლები (ე.წ. სეფადექსი) ძლიერ შეშუპდება და ქმნის გელს, რომელიც ივსება სვეტში. მეთოდი ემყარება იმ ფაქტს, რომ დიდი მოლეკულები არ შედიან შიდა წყლის ფაზაში, ხოლო უფრო მცირე მოლეკულები პირველად შედიან "საცრის" ფორებში, როგორც ჩანს, იჭერენ მათში და, შესაბამისად, მოძრაობენ უფრო დაბალი სიჩქარით. შესაბამისად, უმაღლესი ცილის მქონე ცილები პირველი შედიან მიმღებში. ცოტა ხნის წინ, ფოროვანი მინის მძივები სულ უფრო მეტად გამოიყენება მოლეკულური საცრებისთვის შეღწევადობის ქრომატოგრაფიაში.
ბიოქიმიაში ელექტროფორეზული მეთოდი ემყარება განსხვავებას მოლეკულების მოძრაობის სიჩქარეში ელექტრული ველში (ამინომჟავები, პეპტიდები, ცილები, ნუკლეინის მჟავები).
მგზავრობის სიჩქარეში განსხვავება დამოკიდებულია:
1. მოლეკულის q– დან: რაც მეტია მთლიანი q, მით უფრო დიდია მოლეკულების მობილურობა. Q მნიშვნელობა დამოკიდებულია pH- ზე;
2. მოლეკულების ზომაზე: რაც უფრო დიდია მოლეკულები, მით ნაკლებია მათი მობილურობა. ეს გამოწვეულია ხახუნის ძალების გაზრდით და დიდი მოლეკულების ელექტროსტატიკური ურთიერთქმედებით გარემო;
3. მოლეკულების ფორმაზე: ერთი და იმავე ზომის, მაგრამ განსხვავებული ფორმის მოლეკულებს, მაგალითად, ფიბრილებს და ცილის გლობულებს განსხვავებული სიჩქარე აქვთ. ეს გამოწვეულია ხახუნის და ელექტროსტატიკური ურთიერთქმედების ძალებში განსხვავებებით.
ელექტროფორეზის სახეები
ა) იზოელექტრული ფოკუსირება. გამოყოფა ხდება ვერტიკალურ სვეტზე დეგ. pH და ძაბვა. ამფოლიტების სპეციალური მატარებლების დახმარებით, სვეტში იქმნება სეტყვა. pH 0 -დან 14 -მდე. სვეტში მოთავსებულია ნივთიერებების ნარევი, მე ვაერთებ ელექტრულ დენს. თითოეული კომპონენტი გადადის სვეტის იმ ნაწილზე, სადაც pH მნიშვნელობა შეესაბამება მის იზოელექტრულ წერტილს და იქ ჩერდება, ანუ ფოკუსირდება.
უპირატესობა: ცილების გამოყოფა, გაწმენდა და იდენტიფიცირება ხდება ერთ საფეხურზე. მეთოდს აქვს მაღალი გარჩევადობა (0.02 pI).
ბ) იზოტაქოფორეზი არის ელექტროფორეზი დამხმარე მედიაზე. ელექტრული დენის ჩართვის შემდეგ, ყველაზე მაღალი მოძრაობის მქონე იონები გადადიან პირველ შესაბამის ელექტროდზე, ყველაზე დაბალი - უკანასკნელი შუალედური მობილურობით - შუაშია.
გ) დისკის ელექტროფორეზი - მოწყობილობა შედგება ორი ჭურჭლისგან, რომელსაც აქვს ბუფერი - ზედა და ქვედა, რომელიც დაკავშირებულია ვერტიკალური მილებით მრავალფუნქციური გელის შემცველი. როგორც იონიზებული ნაწილაკები მოძრაობენ ელექტრული დენის მოქმედების ქვეშ. უმაღლესი ფორიანობა გელის თავზეა.
დ) იმუნოელექტროფორეზი - ელექტროფორეზის იმუნოდიფუზიასთან შერწყმის მეთოდი (კომპლექსურ ფიზიოლოგიურ ნარევებში ანტიგენების გამოვლენის მიზნით). ანტიგენების ნარევი და ანტისხეულების ნაზავი მოთავსებულია ერთმანეთის პერპენდიკულარულ სპეციალურ გადამყვანზე. როდესაც ელექტრული დენი ჩართულია, ისინი იყოფა ცალკეულ ნივთიერებებად და ვრცელდება გელის გადამზიდავზე. ანტიგენის შეკრების ადგილას შესაბამის ანტისხეულთან ერთად ხდება კონკრეტული ნალექის რეაქცია რკალის სახით. ჩამოყალიბებული რკალის რაოდენობა შეესაბამება ანტიგენების რაოდენობას.

ბატონი ცილების განსაზღვრის მეთოდები

დიდი რაოდენობით ცილები ქიმიური შემადგენლობადა ამინომჟავების თანმიმდევრობა არ არის დადგენილი (1010-1012 ცილა); ამიტომ, ბატონი ამისათვის გამოიყენება სხვადასხვა მეთოდი.
ა) დალექვის მეთოდი - ბატონი განსაზღვრა ხდება სპეციალურ ცენტრიფუგებში (პირველი ცენტრიფუგა შემოთავაზებულია შვედი ბიოქიმიკოსის სვედბერგის მიერ), რომლის დროსაც შესაძლებელია ცენტრიდანული აჩქარების შექმნა, რაც 200 ათასზე მეტჯერ ან აჩქარებაზეა დედამიწის გრავიტაცია. Mr განისაზღვრება მოლეკულების V დალექვით. როდესაც მოლეკულები ცენტრიდან პერიფერიაზე გადადიან, იქმნება მკვეთრი ცილა-გამხსნელი ინტერფეისი. ნალექის სიჩქარე გამოიხატება დანალექის მუდმივობით (S):

სადაც V არის ცილა-გამხსნელის საზღვრის გადაადგილების სიჩქარე (სმ / წმ);
 - როტორის კუთხური სიჩქარე (რადი / წმ);
 - მანძილი როტორის ცენტრიდან უჯრედის შუამდე ცილის ხსნარით (სმ).
დალექვის მუდმივის S მნიშვნელობა, რომელიც არის 110–13 С, პირობითად მიიღება 1 და ეწოდება 1 სვედბერგი (S). S პროტეინებისთვის არის 1-50 S დიაპაზონში, ზოგჯერ 100 S.
ცილების ბატონი განისაზღვრება შვედბერგის განტოლებით:

სადაც R არის უნივერსალური გაზის მუდმივი;
T არის აბსოლუტური ტემპერატურა კელვინში;
S არის დალექვის მუდმივი;
D არის დიფუზიის კოეფიციენტი;
 არის გამხსნელის სიმკვრივე;
V არის გაზის ნაწილობრივი სპეციფიკური მოცულობა.
ეს მეთოდი ძვირია ძვირადღირებული ტექნიკის გამო.
უფრო მარტივი და იაფი:
ბ) გელის ფილტრაცია სეფადექსის თხელი ფენით.
ცილის გზის სიგრძე (მმ -ში) ლოგარითმულია Mr.
X - კალიბრაციის გრაფაში სამიზნე ცილის ბატონი.
გ) დისკის ელექტროფორეზი პოლიაქრილამიდის ფენაში - ასევე არსებობს კავშირი კალიბრაციის ცილების ლოგარითმ Mr- სა და მათ გზას შორის.

ცილის ერთგვაროვნების განსაზღვრის მეთოდები

იზოლირებული ცილის სიწმინდე განისაზღვრება:

• ულტრაცენტრიფუგირება;
• დისკის მეთოდი - ელექტროფორეზი;
• სხვადასხვა იმუნოქიმიური მეთოდები;
• ცილის ხსნადობის განსაზღვრა (ნორტროპის მეთოდი) ემყარება ფაზის წესს, რომლის მიხედვითაც მოცემული ექსპერიმენტულ პირობებში სუფთა ნივთიერების ხსნადობა დამოკიდებულია მხოლოდ ტემპერატურაზე, მაგრამ არ არის დამოკიდებული ნივთიერების კონცენტრაციაზე მყარ ფაზაში.

თუ ცილა ერთგვაროვანია, მაშინ გრაფიკზე ნაჩვენებია ერთი გადახრა (a), თუკი ცილების მინარევებია (b, c), მაშინ ვიღებთ გაჯერების მრუდის რამოდენიმე გადახრას. ყველა ცილას აქვს ხსნადობის საკუთარი ინდივიდუალური მოსახვევები.

480 რუბლი | 150 UAH | $ 7.5 ", MOUSEOFF, FGCOLOR," #FFFFCC ", BGCOLOR," # 393939 ");" onMouseOut = "დაბრუნება nd ();"> დისერტაცია - 480 რუბლი, მიწოდება 10 წუთი, საათის გარშემო, კვირაში შვიდი დღე

კაიშევა, ანა ლეონიდოვნა. ცილებისა და ცილოვანი კომპლექსების მასობრივი სპექტრომეტრიული იდენტიფიკაცია ატომური ძალის მიკროსკოპის ჩიპებზე: დისერტაცია ... ბიოლოგიურ მეცნიერებათა კანდიდატი: 03.01.04 / კაიშევა ანა ლეონიდოვნა; [დაცვის ადგილი: ნაუშნი. გაცემული. ბიომედის ინსტიტუტი. ქიმია მათ. ვ.ნ. ორეხოვიჩი RAMS] .- მოსკოვი, 2010.- 104 გვ.: ავად. RSL OD, 61 10-3 / 1308

შესავალი

თავი 1. ლიტერატურის მიმოხილვა 10

1.1. სამეცნიერო და ტექნიკური საფუძვლების ანალიზი უაღრესად მგრძნობიარე პროტეომიული ტექნოლოგიების სფეროში

1.2 C ჰეპატიტის ვირუსის მახასიათებლები 20

1.2.1 C ჰეპატიტის დიაგნოსტიკის მეთოდები 22

1.2.2 C ჰეპატიტის ცილოვანი ცილოვანი მარკერები 25

თავი 2. მასალები და მეთოდები 28

2.1 AFM ჩიპი 28

2.2 ცილის პრეპარატები და რეაგენტები 29

2.3 AFM ანალიზი 30

2.4 მასის სპექტრომეტრული ანალიზის ნიმუშის მომზადება 31

2.5 მასის სპექტრომეტრიის ანალიზი 33

2.5.1 ცილების MALDI-MS ანალიზი AFM ​​ჩიპის ზედაპირზე 33

2.5.2 ცილების ESI-MS ანალიზი AFM ​​ჩიპის ზედაპირზე 34

თავი 3. შედეგები და მათი განხილვა 35

3.1 ცილების MS- იდენტიფიცირება "ქიმიური თევზაობის" საშუალებით AFM ჩიპის ზედაპირზე ანალიტიკური ხსნარიდან

3.2 პროტეინების იდენტიფიკაცია ბიოსპეციალურად დაჭერილი AFM ​​ჩიპის ზედაპირზე ანალიტიკური ხსნარიდან

3.3 ცილების MS იდენტიფიკაცია AFM ჩიპის ზედაპირზე ბიოსპეციფიურად აღებულია სისხლის შრატის ნიმუშებიდან

დასკვნა 83

ლიტერატურა

მუშაობის გაცნობა

ნაწარმოების აქტუალობა.

თანამედროვე ბიოქიმიის ერთ -ერთი პრიორიტეტული მიმართულებაა პროტეომული ანალიზის ეფექტური ანალიტიკური მეთოდების შექმნა, რომლის მთავარი ამოცანაა სხეულის ცილების გამოვლენა და ინვენტარიზაცია, მათი სტრუქტურისა და ფუნქციების შესწავლა და ცილის ურთიერთქმედების იდენტიფიცირება. ამ პრობლემის მოგვარება შექმნის ახალ სისტემებს დაავადებების დიაგნოსტიკისა და მათი მკურნალობისათვის. თანამედროვე პროტეომული ანალიზის სტანდარტული მეთოდები ემყარება ცილოვანი მრავალკომპონენტიანი ნარევების გამოყოფას ქრომატოგრაფიის გამოყენებით, ელექტროფორეზი მასის სპექტრომეტრიულ მეთოდებთან (MS) ცილის იდენტიფიკაციისათვის. მიუხედავად სტანდარტული MS ანალიზის უდავო უპირატესობისა ცილის მოლეკულების იდენტიფიკაციის სიჩქარისა და საიმედოობის თვალსაზრისით, მას აქვს მნიშვნელოვანი შეზღუდვები დაბალი

ანალიზის კონცენტრაციის მგრძნობელობა 10 "10" M დონეზე და ბიოლოგიურ მასალაში ცილის შემცველობის მაღალი დინამიური დიაპაზონი. ამავდროულად, ფუნქციონალური ცილების უზარმაზარი რაოდენობა, მათ შორის ისეთი სოციალურად მნიშვნელოვანი დაავადებების ბიომარკერები, როგორიცაა ვირუსული ჰეპატიტი B და C, სიმსივნის მარკერები და ა.შ., იმყოფებიან სისხლის პლაზმაში 10 "Mi ნაკლები კონცენტრაციის დიაპაზონში.

ანალიზის კონცენტრაციის მგრძნობელობის ამ მეთოდოლოგიური შეზღუდვის გადალახვის ერთ -ერთი გზაა ბიომოლეკულური დეტექტორების გამოყენება, რაც იძლევა ერთი მოლეკულის და მათი კომპლექსების რეგისტრაციის საშუალებას და თეორიულად არ აქვს შეზღუდვები კონცენტრაციის მგრძნობელობაში. ბიომოლეკულური დეტექტორები მოიცავს დეტექტორებს, რომლებიც დაფუძნებულია ნანოტექნოლოგიურ მოწყობილობებზე, როგორიცაა ატომური ძალის მიკროსკოპები (AFM), ნანოსადენების დეტექტორები, ნანოპორები და რიგი სხვა დეტექტორები. AFM დეტექტორების უნიკალური მგრძნობელობა იძლევა ვიზუალიზაციას ინდივიდუალური ცილის მოლეკულების და ითვლის მათ რიცხვს. AFM- ის ბიომოლეკულური დეტექტორის გამოყენებისას აუცილებელია სპეციალური ჩიპების გამოყენება, რაც შესაძლებელს გახდის ანალიზის ბიოლოგიური მაკრომოლეკულების კონცენტრაციას ინკუბაციის ხსნარის დიდი მოცულობიდან შეზღუდული ჩიპის ზედაპირზე. შესწავლილი ცილის ობიექტები შეიძლება იყოს კონცენტრირებული ჩიპის ზედაპირზე როგორც ფიზიკური ან ქიმიური ადსორბციის გამო, ასევე ბიოსპეციფიკური ურთიერთქმედების გამო (AFM- ბიოსპეციფიკური თევზაობა).

თუმცა, პრაქტიკაში, AFM დაფუძნებული ნანოდეტექტორების გამოყენება შემოიფარგლება იმით, რომ ჩიპის ზედაპირზე ინდივიდუალური ცილის მოლეკულების ვიზუალიზაციის მიუხედავად, ასეთ დეტექტორებს არ შეუძლიათ მათი იდენტიფიცირება, რაც განსაკუთრებით მნიშვნელოვანია კომპლექსური ცილის შესწავლისას ნარევები, მათ შორის ბიოლოგიური მასალა. აქედან გამომდინარე, ანალიზის მეთოდის შემუშავება, რომელიც ავსებს AFM მეთოდის შესაძლებლობებს, როგორც ჩანს, გადაუდებელი ამოცანაა. დღემდე, ერთადერთი პროტეომიული მეთოდი, რომელიც შესაძლებელს ხდის ცილის მოლეკულების ცალსახად და საიმედოდ იდენტიფიცირებას, არის MS ანალიზი. სადისერტაციო ნაშრომში შემუშავდა მიდგომა, რომელიც აერთიანებს AFM მეთოდის მაღალ მგრძნობელობას და საიმედო MS იდენტიფიკაციას პროტეინებისა და მათი კომპლექსების დასადგენად ანალიტიკური ხსნარიდან.

კვლევის მიზანი და ამოცანები.

ამ სამუშაოს მიზანი იყო ცილებისა და ცილოვანი კომპლექსების მასობრივი სპექტრომეტრიული იდენტიფიკაცია ბიომასალებში, ატომური ძალის მიკროსკოპის გამოყენებით.

ამ მიზნის მისაღწევად გადაწყდა შემდეგი ამოცანები:

შემუშავებულია AFM ჩიპის ზედაპირზე დაჭერილი ცილების MS იდენტიფიკაციის ქიმიური ან ბიოსპეციფიკური თევზაობის გამოყენებით;

შემუშავებულია პირობები AFM ​​ჩიპის ზედაპირზე ცილების ფერმენტული ჰიდროლიზისთვის MS შემდგომი იდენტიფიკაციისათვის;

AFM ჩიპის ზედაპირზე მოდელის ცილების MS იდენტიფიკაცია განხორციელდა;

ცილების MS იდენტიფიკაცია AFM ჩიპის ზედაპირზე, ბიოსპეციფიურად დაჭერილი მრავალკომპონენტიანი ნარევიდან (შრატიდან), განხორციელდა.

მუშაობის მეცნიერული სიახლე .

დისერტაციაში შემუშავდა სქემა, რომელიც საშუალებას აძლევს MS- ს განსაზღვროს ცილები და ცილოვანი კომპლექსები, რომლებიც ამოღებულია ხსნარიდან ან მრავალკომპონენტიანი ნარევიდან AFM ჩიპის ზედაპირზე. ამისათვის შეირჩა ოპტიმალური პირობებინიმუშების მომზადება, მათ შორის ჰიდროლიზის რეჟიმი (ტემპერატურა, ტენიანობა, ტრიპსინოლიზური ნარევის შემადგენლობა, ტრიპსინოლიზის დრო) ცილის მოლეკულების კოვალენტურად და არაკოვალენტურად იმობილიზებული AFM ​​ჩიპის ზედაპირზე. ამ სამუშაოს თავისებურება ის იყო, რომ ფერმენტული ჰიდროლიზის სტანდარტულ პროტეომულ პროტოკოლებთან შედარებით, MS ანალიზისთვის ნიმუშების მომზადება განხორციელდა არა ხსნარში, არამედ შეზღუდულ ადგილას.

ჩიპის ზედაპირი. შემუშავებულმა სქემამ შესაძლებელი გახადა MS– ის ანალიზის ეფექტურად ჩატარება და AFM ჩიპის ზედაპირზე ორივე ინდივიდუალური ცილის და ცილოვანი კომპლექსის იდენტიფიცირება. შესწავლილი ცილების პროტეოტიპული პეპტიდების MS ანალიზი განხორციელდა ორი სახის იონიზაციის გამოყენებით (მალდიდა EST)და ორი სახის დეტექტორი (ფრენის დრო და იონური ხაფანგი). AFM- ბიოსპეციფიკური თევზჭერის და MS- ის კონიუგაციის შემუშავებული სქემა ასევე წარმატებით იქნა შემოწმებული სისხლის შრატის ნიმუშებში C ჰეპატიტის ვირუსის (HCV) (HCVcoreAg და E2) ცილოვანი მარკერების გამოვლენისათვის.

ნაწარმოების პრაქტიკული მნიშვნელობა .

ამ სამუშაოს შედეგები იძლევა შესაძლებლობას შექმნას უაღრესად მგრძნობიარე პროტეომიული მეთოდები ეტიკეტებისა და დამატებითი პროცედურების გარეშე ბიოლოგიური მასალის ცილების გამოვლენის ნიმუშების მოსამზადებლად დაბალი კონცენტრაციით, მათ შორის სისხლის შრატში. შემოთავაზებულია ატომური ძალის მიკროსკოპიისა და მასის სპექტრომეტრიის საფუძველზე მიდგომა, რაც შესაძლებელს გახდის ადამიანის შრატში C ჰეპატიტის ვირუსის ცილოვანი მარკერების გამოვლენას და იდენტიფიცირებას.

ეს მიდგომა შეიძლება გამოყენებულ იქნას იმ მოვლენებში, რომლებიც მიზნად ისახავს ახალი დიაგნოსტიკური ჩიპების შექმნას, სოციალურად მნიშვნელოვანი დაავადებების ფართო სპექტრის ბიომარკერების ძიებას.

სამუშაოს მოწონება.

კვლევის ძირითადი შედეგები წარმოდგენილი იყო "ნანოტექნოლოგიის 1-ლი, მე -2 და მე -3 საერთაშორისო ფორუმზე" (მოსკოვი, 2008-2010 წწ); "რუსეთის ბიოქიმიკოსთა და მოლეკულურ ბიოლოგთა საზოგადოების IV კონგრესი", ნოვოსიბირსკი, 2008; საერთაშორისო კონგრესზე "ადამიანის პროტეომი", ამსტერდამი, 2008; საერთაშორისო კონგრესზე "ადამიანის პროტეომი", სიდნეი, 2010 წ.

პუბლიკაციები.

ნაშრომის სტრუქტურა და მოცულობა.

დისერტაცია მოიცავს შესავალს, ლიტერატურის მიმოხილვას, მასალებისა და კვლევის მეთოდების აღწერას, კვლევის შედეგებს და მათ განხილვას, დასკვნებს, დასკვნებს და მითითებების ჩამონათვალს. ნაშრომი წარმოდგენილია 104 გვერდზე, ილუსტრირებულია 33 ფიგურითა და 4 ცხრილით, ცნობარების სია 159 სათაურისგან შედგება.

სამეცნიერო და ტექნიკური საფუძვლების ანალიზი უაღრესად მგრძნობიარე პროტეომიული ტექნოლოგიების სფეროში

თანამედროვე მეცნიერებაში ერთ -ერთი პრიორიტეტული მიმართულებაა ორგანიზმში სხვადასხვა სახის ცილების როლის აღმოჩენა და გარკვევა, ასევე მოლეკულური მექანიზმების გააზრება, რაც იწვევს დაავადებების განვითარებას.

პროტეომული მეთოდების მუდმივი გაუმჯობესების მიუხედავად, ახლად აღმოჩენილი დაავადების ბიომარკერების რაოდენობა პრაქტიკულად / უცვლელი დარჩა გასული ათწლეულის განმავლობაში. ეს გამოწვეულია იმით, რომ ტრადიციული პროტეომიული მეთოდების გამოვლენის კონცენტრაციის ლიმიტი არ აღემატება 10 "9 მ და ნაკლები), ბიოლოგიური მასალის ბიომარკერების ჩათვლით. ვინაიდან შეიძლება ვივარაუდოთ, რომ სწორედ ამ კონცენტრაციის დიაპაზონშია განლაგებული დაავადებების უმეტესობის ცილოვანი მარკერები.

ერთ -ერთი აქტიურად განვითარებადი მიმართულება, რომელიც შესაძლებელს ხდის ანალიზის კონცენტრაციის მგრძნობელობის გარკვეულწილად გაზრდას, არის ანალიტიკური კომპლექსების შექმნა ნანოქრომატოგრაფიულ და ნანოელექტროფორეტიკულ სისტემებზე, რომლებიც თავსებადია მასის სპექტრომეტრებთან.

ნანოქრომატოგრაფიულმა სისტემამ მასის სპექტრომეტრიასთან და ელექტრო სპრეის იონიზაციასთან ერთად შესაძლებელი გახადა პროტეინების გამოვლენის მგრძნობელობის გაზრდა სიდიდის ორი ბრძანებით მაღალი გარჩევადობის ქრომატოგრაფიასთან (HPLC) შედარებით. ასეთი დაწყვილებული სისტემების კონცენტრაციის მგრძნობელობის ზღვარი შემოიფარგლება ელექტროფორეზის / ქრომატოგრაფიის სტადიის მგრძნობელობით და არ აღემატება 10-12 მ ცალკეულ ცილებს (მაგალითად, ციტოქრომ C და ბრადიკინინს).

ამჟამად, ქრომატოგრაფიული მეთოდები ცალკეულ დამოუკიდებელ მიმართულებებში გადაიზარდა - SELDI MS ანალიზი (ზედაპირზე გაძლიერებული ლაზერული დესორბცია და იონიზაცია / ფრენის მასის სპექტრომეტრიის დრო), ცილოვანი თევზის მეთოდები მაგნიტური მიკრონაწილაკების გამოყენებით. ამ ტექნოლოგიებში SELDI ჩიპების ჰიდროფობიური ან დამუხტული ზედაპირებია. ან მაგნიტური მიკრონაწილაკები მასის სპექტრომეტრიულ ანალიზთან ერთად წარმატებით გამოიყენება: ამისთვის? ცალკეული ტიპების იდენტიფიცირება და განსაზღვრა; ცილები და სისხლის შრატის ცილების / პეპტიდების პროფილირებისათვის [c, 8; \ B, 15]. SEbDIi МЄ არის: მძლავრი მიდგომა, რომელიც შესაძლებელს ხდის ბიომასალის შესწავლას ბიომოლეკულების (პროტეინები. პეპტიდები) ქიმიურად გააქტიურებული ადსორბციის გზით? ზედაპირი (კათიონის / ანიონის გაცვლის ჩიპი) რასაც მოჰყვება ადსორბირებული მასის სპექტრომეტრიული ანალიზი: მოლეკულები:. გამოიყენება SEEDPМЄ მიდგომა; პროტეინ-ბიომასალის პროფილირება; და ცოტა ხნის წინ: დაიწყო გამოყენება როგორც "დიაგნოზი, პროტეომიული შტრიხკოდების მიხედვით" [17] .. ასეთი "შტრიხკოდის დიაგნოსტიკის" არსი არის იდენტიფიცირება? ბიოლოგიური ნიმუშის ცილის პროფილის მახასიათებლები; ასოცირდება კონკრეტულ დაავადებასთან: ასე რომ, ცნობილია; რისთვის არის კიბო, ბიომასალის "პროტეომიული შტრიხ" მნიშვნელოვნად განსხვავდება ინდივიდების ჯანსაღი ჯგუფებისგან: შესაბამისად, კონტროლი ცილის ცვლილებებზე; ბიომასალის შემადგენლობა შეიძლება გახდეს დაავადების ადრეული დიაგნოზის საფუძველი. Ზე; დღეს, SELDI მიდგომის გამოყენებით? MЄ მარკერები გამოვლენილია. კუჭის, საკვერცხეების, პროსტატისა და ძუძუს კიბო: ამ მეთოდის შეზღუდვა 5 არის მაღალი გარჩევადობისა და საიმედოობის მქონე ცილების გამოვლენის უუნარობა, რაც განსაკუთრებით მნიშვნელოვანია, როდესაც; მრავალკომპონენტიანი ნარევების ანალიზი, როგორიცაა ბიოლოგიური მასალა.

არსებული ანალიტიკური სისტემების დაბალი კონცენტრაციის მგრძნობელობის პრობლემის გარდა, ბიოლოგიური მასალის პროტეომული ანალიზის დაბრკოლება გახდა ცილების კონცენტრაციების ფართო დინამიური დიაპაზონი, განსაკუთრებით სისხლის შრატში, რომელიც მერყეობს 1 -დან (GM- დან ცილის ცალკეულ მოლეკულამდე). მაღალი ასლი (ძირითადი) ცილები ხელს უშლის ასეთ სისტემებში დაბალი ასლის (მცირე) ცილების იდენტიფიცირებას და იდენტიფიცირებას.

ცილების ფართო კონცენტრაციის პრობლემა ბიომასალში შეიძლება გადაწყდეს ძირითადი ცილის ფრაქციებიდან სისხლის შრატის ამოწურვის მეთოდების გამოყენებით, მრავალკომპონენტიანი ნარევების გამოყოფის მეთოდით და ნანოტექნოლოგიური მეთოდებით, რომელიც დაფუძნებულია რთული ნარევებიდან ცილის ანალიზის მოლეკულების ბიოსპეციფიკურ და ქიმიურ თევზაობაზე. ჩიპების ზედაპირზე სხვადასხვა ბიოსენსორებამდე ან გააქტიურებულ ზედაპირზე.მაგნიტური მიკროსფეროები.

ტრადიციულად, ერთგანზომილებიანი, უფრო ხშირად ორგანზომილებიანი გელის ელექტროფორეზი გამოიყენება ცილების მრავალკომპონენტიანი ნარევების გამოსაყოფად. ცილის გამოყოფის პრინციპი ორგანზომილებიანი გელის ელექტროფორეზის მეთოდებით ემყარება განსხვავებას ცილებს შორის მათი მოლეკულური წონის Hf იზოელექტრონული წერტილების მნიშვნელობების მიხედვით. პროტეომიკაში, ეს მიდგომები გამოიყენება ბიომასალის (ქსოვილის, სისხლის პლაზმის და სხვა) ცილების რუქების აღსადგენად. მასობრივი სპექტრომეტრიით 1D და / ან 2D ელექტროფორეზის კომბინაცია იძლევა გამოყოფილი და ვიზუალიზებული ცილების იდენტიფიკაციის საშუალებას. თუმცა, ორგანზომილებიანი გელის ელექტროფორეზის პროცედურა ჯერ კიდევ არ არის ავტომატიზირებული, ის საკმაოდ რთული და შრომატევადია, მოითხოვს ოპერატორის მაღალ კვალიფიკაციას და ანალიზის შედეგები ხშირად ცუდად მეორდება.

ცილების გამოყოფის უფრო მოსახერხებელი პროცედურა ორგანზომილებიან ელექტროფორეზთან შედარებით არის მაღალი გარჩევადობის ქრომატოგრაფია (HPLC); რომელიც არის ავტომატიზირებული პროცედურა, რომელიც საშუალებას გაძლევთ ამოიღოთ მაღალი ასლის შემცველი ცილები რთული ნარევიდან, რათა შემდგომში გამოავლინოთ დაბალი ასლის ცილები.

კომპლექსურ ნარევებში ცილების პირდაპირ იდენტიფიცირების მიზნით, ქრომატოგრაფიული სვეტი შეიძლება დაკავშირებული იყოს მასის სპექტრომეტრთან. თუმცა, ხელუხლებელი ცილები პრაქტიკულად არ ემორჩილება HPLC– ს მაღალი ხარისხის გამოყოფას, ვინაიდან ისინი დენატურირებული ხდება ანალიზის დროს (ორგანული გამხსნელების საშუალო დაბალი და მაღალი კონცენტრაციის pH– ის გამო) და ასევე მასის დაბალი სიზუსტის გამო. სპექტრომეტრული ანალიზი, შესაბამისად, უმეტესი ხელუხლებელი ცილების უშუალო იდენტიფიკაცია, განსაკუთრებით მოლეკულური მასით, რომელიც აღემატება 10 kDa, ხშირად შეუძლებელია. ანალიტიკური გაზომვის სიზუსტე შეიძლება გაუმჯობესდეს ცილების ჰიდროლიზური დაშლით პეპტიდურ ფრაგმენტებზე, მოლეკულური მასით 700 -დან 4000 Da- მდე პროტეაზების გამოყენებით; როგორიცაა ტრიპსინი (ქვემოდან ზემოთ ტექნოლოგია). ნარევში ცილების ხარისხობრივი განცალკევების მისაღწევად გამოიყენება რამდენიმე ქრომატოგრაფიული პროცედურის კომბინაცია, ე.წ. მრავალგანზომილებიანი ქრომატოგრაფია.

ჰეპატიტის დიაგნოზის მეთოდები

ამჟამად, C– ჰეპატიტის ცილის დიაგნოზისთვის გამოიყენება ანტი- HCVcore ტესტის სისტემები. პირველი ELISA ტესტები ანტი-HCVcore ანტისხეულების არსებობის დასადგენად ხელმისაწვდომი გახდა 1990-იანი წლების დასაწყისში, მაგრამ მათ ჰქონდათ დაბალი მგრძნობელობა და სელექციურობა. მოგვიანებით, 90-იანი წლების ბოლოს, გამოჩნდა ELISA ტესტები ახალი თაობის ანტი- HCVcore– ისთვის, რომელსაც ჰქონდა საკმაოდ მაღალი მგრძნობელობა დაახლოებით 95-99% და შეეძლო HCV– ს გამოვლენა ინფექციიდან რამდენიმე თვის შემდეგ.

მაგალითად, 1996 წელს რუსეთის ბაზარზე გამოჩნდა Vector-Best (ნოვოსიბირსკი) და Diagnostic Systems (ნიჟნი ნოვგოროდი) მიერ შემუშავებული სატესტო სისტემები ანტისხეულების აღმოსაჩენად-ანტი HCV IgM კლასი. სეროდიაგნოსტიკაში IgM ანტისხეულების როლი არ არის საკმარისად შესწავლილი, თუმცა ზოგიერთმა კვლევამ აჩვენა ამ მარკერის მნიშვნელობა C ქრონიკული ჰეპატიტის გამოვლენისათვის. ასევე დადგინდა, რომ კორელაცია პაციენტებში RNA ვირუსის გამოვლენასა და ანტი-HCV IgM- ს შორის არის 80-95%. C ვირუსული ჰეპატიტის განვითარების ფაზის დასადგენად Afanasiev A.Yu. და სხვებმა გამოიყენეს კოეფიციენტი, რომელიც ასახავს ანტი HCV IgG– ის და HCV IgM– ის თანაფარდობას პაციენტთა სისხლში. დღემდე შემუშავებულია მრავალი ფერმენტთან დაკავშირებული იმუნოსორბენტული ანალიზის (ELISA) სისტემა, რომელიც ავლენს მოცირკულირე ანტისხეულებს B ჰეპატიტის ვირუსის მრავალი ეპიტოპების მიმართ.

თანამედროვე ლაბორატორიული დიაგნოსტიკა: ვირუსული ჰეპატიტი Є ტარდება მოსკოვის უმეტეს სამედიცინო დაწესებულებებში; რუსეთის ფედერაციის ჯანდაცვის სამინისტროსა და ჯანდაცვის დეპარტამენტის არსებული ბრძანებების შესაბამისად: მოსკოვი და არის თუ არა იმუნოგლობულინების განსაზღვრა? G კლასი ჰეპატიტის ვირუსამდე (ანტი HGV IgG) პაციენტთა სისხლის შრატში. ამ მარკერის იდენტიფიკაცია საშუალებას იძლევა ვიმსჯელოთ მიმდინარე ან წინა ინფექციის არსებობაზე.

მეთოდების ნაკლოვანებები; EEISA- ზე დაფუძნებული გამოვლენები, დაბალი მგრძნობელობის გარდა (მეტია GO "12 M) j ასევე გამოწვეულია ცრუ გამოვლენით; ვირუსული ჰეპატიტი patients პაციენტებში, პოსტ-ინფექციური იმუნიტეტის გამო., ანტისხეულების ჯვარედინი რეაქტიულობა, ასევე არასაკმარისი მგრძნობელობა მწვავე პერიოდში) ფაზა BFG BI CONNECTION? S: ეს აქტიურად განაგრძობს მგრძნობიარე, სპეციფიკურ, სწრაფ და ადვილად განსახორციელებელ მეთოდებს "ჰეპატიტის" 1 მარკერის გამოვლენის მიზნით.

სხვა ჯგუფიგამოვლენის მეთოდები, ვირუსული ჰეპატიტი შრატში: სისხლი შედგება І რეგისტრაციისგან; RNA BES PCR გამოყენებით; რნმ -ის განსაზღვრა. BFG მეთოდები; HRS არ შეიძლება გამოყენებულ იქნას როგორც პირველადი ტესტი - დადასტურება ან გამორიცხვა; დიაგნოზი; მაგრამ; შესაძლოა; სასარგებლოა დიაგნოზის დასამტკიცებლად: BFG– ის დიაგნოზი 1 კეთდება რნმ – ის 5 – კოდირებული რეგიონის ანალიზით. თუმცა, ანალიზის შედეგები განსხვავდება სხვადასხვა BFG გენოტიპებს შორის.

ბიოლოგიური მიკროჩიპები გამოჩნდა რუსეთის ბაზარზე, რაც საშუალებას იძლევა - BFG გენოტიპირება და - განსაზღვროს ეფექტური ანტივირუსული სქემა; თერაპია. ეს ბიოჩიპი არის ოლიგონუკლეოტიდის ჩიპი BFG გენოტიპირებისთვის, რომელიც დაფუძნებულია NS5B რეგიონის ანალიზზე. მიღებული შედეგები მიუთითებს ბიოჩიპის უნარზე გამოავლინოს HCV- ს ყველა 6 გენოტიპი და 36 ქვეტიპი, მათ შორის ყველაზე ვირუსული და წამლებისადმი მდგრადი ფორმები.

ერთის მხრივ, PCR ანალიზის მეთოდები არის ჰიპერმგრძნობიარე და იძლევა სიგნალის გამოვლენას და გაძლიერებას ნიმუშში მხოლოდ ერთი რნმ -ის მოლეკულისგან, მაგრამ მეორეს მხრივ, ეს მეთოდები ხასიათდება ცრუ პოზიტიური შედეგებით ნიმუშების შემთხვევითი დაბინძურების, ცრუ უარყოფითი შედეგების გამო. ვირუსის მაღალი ცვალებადობის და ანალიზის შედარებით მაღალი ღირებულების გამო. ერთიდაიგივე პიროვნებაშიც კი, HCV რნმ -ის დონე შეიძლება პერიოდულად შეიცვალოს მილიოტრაზით მეტი, რაც იწვევს ცრუ უარყოფით შედეგებს, დაბალი? ვირუსის რეპლიკაცია ან თუ ვირუსი ქსოვილებში შენარჩუნებულია სისხლის მიმოქცევის გარეშე. სხვადასხვა ლაბორატორიებში RІZH, HCV- ის რაოდენობრივი განსაზღვრის შედეგები არ არის საკმარისად შეთანხმებული.

HCV- ს ცილოვანი ანტიგენები განსაკუთრებით მნიშვნელოვანია ვირუსული ჰეპატიტის C ადრეული გამოვლენისათვის Bt ბიომასალებში იმის გამო, რომ ისინი გამოჩნდებიან 1 სისხლის შრატში რამდენიმე კვირით ადრე, თუნდაც ორგანიზმის სრულფასოვანი იმუნური პასუხის განვითარებამდე.

C ჰეპატიტის ვირუსის ზედაპირული ანტიგენი HCVcoreAg არის ინფექციის მთავარი მარკერი - ვირუსი, C ჰეპატიტი. იგი გამოვლენილია სხეულის იმუნური პასუხის გამო სისხლში ანტისხეულების გამოჩენამდე 16 კვირით ადრე და კლინიკური ნიშნების განვითარებამდე, ხოლო ის დაფიქსირებულია როგორც მწვავე, ასევე ქრონიკული დაავადებების დროს. არსებობს მხოლოდ ერთი უცხოური კომერციული პროდუქტი (Ortho Clinical Diagnostics) C ჰეპატიტის მწვავე ფაზაში ELISA დიაგნოსტიკისათვის, HCVcoreAg- ის გამოვლენის საფუძველზე.

სტრუქტურული ცილა HCVcoreAg, რომელიც შედგება 121 ამინომჟავის ნარჩენებისგან, მდებარეობს პოლიპეპტიდის N- ტერმინალში და წარმოიქმნება უჯრედული პროტეაზების გავლენის ქვეშ. პირველი პროტეოლიზური ჰიდროლიზი ხდება 191 და 192 ნარჩენებს შორის (C1 ადგილი) და იწვევს E1 გლიკოპროტეინის წარმოქმნას. მეორე განხეთქილების ადგილი (C2) არის 174 და 191 ამინომჟავებს შორის.შემთხვევაში გაყოფის პროდუქტებს ეწოდება p21 და p23. ძუძუმწოვრების რიგ უჯრედებში გამოხატვის ანალიზმა აჩვენა, რომ p21 არის მთავარი პროდუქტი, ხოლო p23 უმნიშვნელო რაოდენობით გვხვდება. შესაძლებელია, რომ C1 და C2 ადგილებში განხეთქილება ერთმანეთთან დაკავშირებული პროცესებია, ვინაიდან p21 წარმოიქმნება იმ პირობებში, როდესაც G2– ზე ჰიდროლიზი არ შეინიშნება [G45]. HCVcoreAg არის ძირითადი რნმ-სავალდებულო ცილა, რომელიც, როგორც ჩანს, ქმნის ვირუსულ ნუკლეოკაფსიდს. ამ ცილის ბიოქიმიური თვისებები ჯერ კიდევ ცუდად არის დახასიათებული. AFM კვლევებმა "C ჰეპატიტის ვირუსის ნაწილაკებზე" შესაძლებელი გახადა HCV კაფსიდის სურათის მიღება.

AFM ჩიპები

მუშაობის ექსპერიმენტულ ნაწილში გამოყენებულია AFM ჩიპების ორი ტიპი. პირველი ტიპი გამოიყენებოდა AFM ჩიპების ზედაპირზე მოდელის ცილების დასადგენად. ეს ჩიპები იყო სუბსტრატები ფუნქციურად აქტიური ქიმიური ჯგუფებით (შემდგომში AFM ​​ჩიპები ქიმიურად გააქტიურებული ზედაპირით), რომლებზეც შესწავლილი მოლეკულები დაიჭირეს და შეუქცევადად იმობილიზებულ იქნა კოვალენტური ბმების გამო, ე.წ. მეორე ტიპის AFM ჩიპები გამოყენებულ იქნა MS იდენტიფიკაციისთვის მათ ზედაპირზე ცილების ბიოსპეციფიურად მოპოვებული ანალიტიკური ხსნარიდან. ბიოლოგიური ზონდები წინასწარ იყო იმობილიზებული ამ ჩიპების ზედაპირზე, სამუშაო ზონებში. მონოკლონური ანტისხეულები ვირუსული ჰეპატიტის B და C მარკერების ცილების (BFB და BFC) ან აპტამერის წინააღმდეგ gpl20 ცილისა და თრომბინის მიმართ ბიოლოგიურ ზონდებად. ბიოსპეციფიკური თევზაობის პროცედურისთვის ჩიპი კოვალენტურად იმობილიზებული ზონდის მოლეკულებით ინკუბირდა. % ანალიზის ხსნარში, რომელიც შეიცავს მხოლოდ გამოვლენილ პროტეინს, ან სისხლის შრატის ნიმუშებს

პირველი ტიპის AFM ჩიპების ზედაპირზე კოვალენტურად იმობილიზებული პროტეინების MS იდენტიფიკაციის ამოცანის შესასრულებლად ჩვენ გამოვიყენეთ: ავიდინი (Agilent, აშშ), HSA (Agilent, აშშ), P450 VMZ (კეთილგანწყობილი პროფესორი A.V. Munro, მანჩესტერის უნივერსიტეტი, დიდი ბრიტანეთი), თრომბინი (სიგმა, აშშ), a-FP და anti-a-FP (USBio, აშშ); მეორე ტიპის AFM ჩიპების ზედაპირზე პროტეინების MS იდენტიფიკაციის ამოცანის შესასრულებლად, ანალიზის ხსნარიდან ბიოსპეციფიურად მოპოვებული, მონოკლონური ანტისხეულები (MCA) გამოყენებულ იქნა გამოძიების მოლეკულებად: anti-HCVcore (Virogen, USA), anti-HBVcore (მოლეკულური დიაგნოსტიკის კვლევითი ინსტიტუტი, მოსკოვი), anti-HBsAg (ალდევრონი, აშშ), როგორც სამიზნე მოლეკულები: HBVcoreAg, HCVcoreAg (Virogen, აშშ) და HBsAg (ალდევრონი, აშშ), gpl20 (სიგმა, აშშ), ტროპონინი (USBio, ᲐᲨᲨ).

გარდა ამისა, მუშაობისას გამოყენებულ იქნა შემდეგი ნივთიერებები: აცეტონიტრილი, იზოპროპანოლი, ფორმიუმის მჟავა, გამოხდილი წყალი (მერკი, აშშ), ტრიფლორმჟავას (TFA), ამონიუმის ბიკარბონატი (სიგმა, აშშ), a-cyano-4-hydroxycinnamic მჟავა ( HCCA), დიჰიდროქსიბენზოინის მჟავა - (DHB) (Bruker Daltonics, გერმანია), ტრიპსინი (პრომეგა, აშშ).

სისხლის შრატის ნიმუშები AFM ​​კვლევებისათვის მიეცა რუსეთის სახელმწიფო სამედიცინო უნივერსიტეტის ბავშვთა ინფექციური დაავადებების დეპარტამენტს, როსპოტრებნადზორის ეპიდემიოლოგიის ცენტრალურ კვლევით ინსტიტუტს და გაბრიჩევსკის MNIIEM: C ჰეპატიტის ვირუსის (HCV) ნაწილაკების არსებობა სისხლის შრატში ნიმუშები დადასტურდა პოლიმერაზას (ჯაჭვური რეაქციის (PCR) მეთოდით) სატესტო სისტემის გამოყენებით "Amplisens HCV Monitor" (ეპიდემიოლოგიის ცენტრალური კვლევითი ინსტიტუტი, რუსეთის ფედერაციის ჯანდაცვის სამინისტრო, მოსკოვი).

AFM ანალიზი ჩატარდა ნანობიოტექნოლოგიის ლაბორატორიაში ბიომედიკური ქიმიის ინსტიტუტში, რუსეთის სამედიცინო მეცნიერებათა აკადემიაში. ცილების და ანტიგენის / ანტისხეულების კომპლექსების ათვლა AFM ჩიპის ზედაპირზე განხორციელდა დაფუძნებულიპროტეინებისა და მათი კომპლექსების შესაბამისი გამოსახულების სიმაღლეების კორელაცია AFM– ით გაზომილი, აღწერილი მეთოდის მიხედვით. გამოყენებული იყო "ACM NTEGRA" (NT-MDT, რუსეთი). AFM გაზომვები განხორციელდა ნახევარკონტაქტის რეჟიმში. NT-MDT NSG10 კონსოლი გამოიყენეს როგორც ზონდები. ნემსების გამრუდების ტიპიური რადიუსი იყო 10 ნმ, რეზონანსული სიხშირე იყო 190 -დან 325 კჰც -მდე დიაპაზონში. ჩიპის სკანირების ფართობი იყო 400 μm2. თითოეული გაზომვა ჩატარდა მინიმუმ 3 ჯერ.

ცილების და აპტამერების იმობილიზაცია AFM ჩიპის ზედაპირზე განხორციელდა შემდეგი პროცედურის მიხედვით.

ცილის ხსნარს (0.1 სმ), რომლის მოცულობაც 2 μl იყო, დაემატა 8 μl NHS / EDC ნარევის ხსნარი (v / v = l / l) და საფუძვლიანად აურიეთ. შედეგად მიღებული ნაზავი წაისვით სილიანიზირებული ჩიპის ზედაპირზე და ინკუბაცია 2 წუთის განმავლობაში ოთახის ტემპერატურაზე. ჩიპი ორჯერ გარეცხილია თერმულ შერეკში 1 მლ დეიონიზებული წყლით 800 rpm და 37C ტემპერატურაზე. AFM ჩიპის ზედაპირზე ცილების იმობილიზაციის ხარისხის მონიტორინგი განხორციელდა ატომური ძალის მიკროსკოპით.

აპტამერების იმობილიზაცია A-M ჩიპის ქიმიურად გააქტიურებულ ზედაპირზე განხორციელდა შემდეგნაირად. DSP– ის მარაგის ხსნარში 1.2 მმ კონცენტრაციით DMSO / ეთანოლში (v / v = l / l) 4 დაემატა PBS ბუფერის ხსნარი 50 მმ (pH 7.4), ასევე მოცულობის 1/1 თანაფარდობით რა მიღებული სამუშაო ხსნარი წაისვა AFM ჩიპის ზედაპირზე და ინკუბაცია 10 წუთის განმავლობაში. ამის შემდეგ, სარეცხი განხორციელდა ეთანოლის 50% -იანი ხსნარით 1 მლ წყალში 15C ტემპერატურაზე 10 წუთის განმავლობაში. აფთამერის ხსნარი 3 JIM კონცენტრაციით იქნა გამოყენებული AFM ​​ჩიპის გააქტიურებულ ზონაში და ინკუბაცია 4 წუთის განმავლობაში აღრევით 800 rpm– ზე. DSP ჯვარედინი კავშირის რეაქტიული ამინო ჯგუფების ბლოკირება განხორციელდა 5 მლ Tris-HCl ხსნარის თანდასწრებით 10 წუთის განმავლობაში 37C ტემპერატურაზე. სარეცხი ბოლო ეტაპი ჩატარდა ორჯერ 1 მლ წყალხსნარით 10 წუთის განმავლობაში 25C

ტრიპსინოლიზური ნარევი, რომელიც შეიცავს 150 მმ NH4HCO3 ბუფერულ ხსნარს, აცეტონიტრილს, 0.5 მ გუანიდინის ჰიდროქლორიდს და გლიცეროლს (pH 7.4) მიმართა AFM ჩიპის ზედაპირს იმობილიზებული ზონდის მოლეკულებით. შემდეგ, 0.5 μl ღორის მოდიფიცირებული ტრიპსინის ხსნარი 0,1 μM კონცენტრაციით დაემატა ბუფერულ ხსნარს. AFM ჩიპი ინკუბირებულია ტენიან გარემოში 2 საათის განმავლობაში 45C მუდმივ ტემპერატურაზე, მის ზედაპირს დაემატა 0.5 μl ტრიპსინის ხსნარი (0.1 μM) და ინკუბაცია გაგრძელდა კიდევ 12 საათის განმავლობაში. ტრიპსინოლიზური ნარევი გარეცხილია AFM ჩიპის ზედაპირზე 10 μL გამხსნელი ხსნარით, რომელიც შეიცავს 70% აცეტონტრილს 0.7% ტრიფლუოროცეტმჟავაში (TFA). ამგვარად მიღებული ჰიდროლიზატი AFM ​​ჩიპის ზედაპირიდან გამხმარი იყო ვაკუუმურ აორთქლებაში 45C და 4200 rpm. შემდეგი, პეპტიდის ნარევი დაიშალა 10 μl 5% ფორმალური მჟავის ხსნარში ან 10 μl 0.7% TFA ხსნარში შემდგომი MS ანალიზისთვის.

MALDI ტიპის იონიზაციით MS ანალიზის ჩატარებისას, ნიმუშების მომზადება განხორციელდა შემდეგნაირად. 10 μL TFA- ს 0.7% -იან ხსნარში დაშლილი ნიმუშები კონცენტრირებულია და დეზალტირდება ZipTip C18 მიკროტიპის გამოყენებით (მილიპორი, აშშ) მწარმოებლის პროტოკოლის შესაბამისად და შერეულია HCCA ან DHB შემცველი გაჯერებული მატრიცის ხსნარით 50% აცეტონიტრილის ხსნარში 0 -ით , 7% TFA. შედეგად მიღებული ნარევი მიმართა MTP- ს MTP ზომის სამიზნეზე.

-ცილების ამოცნობა "ქიმიური თევზაობის" საშუალებით AFM ჩიპის ზედაპირზე ანალიტიკური ხსნარიდან

ექსპერიმენტული მუშაობის ამ ეტაპზე, MS სპექტრები იქნა მიღებული მოდელის ცილებისთვის, რომლებიც ქიმიურად იმობილიზებულია AFM ჩიპების ზედაპირზე ანალიტიკური ხსნარიდან. ავიდინის, HSA, anti-aFP ანალიტიკურ ხსნარში შესწავლილი ცილების კონცენტრაცია იყო 10 "-10" 9 მ, ტროპონინი, aFP და P450 VMZ-10 "6-10" 8 მ.

MS ანალიზი ჩატარდა 6 ტიპის ცილებისთვის, განსხვავებული წარმოშობით, მოლეკულური მასით, ტრიპსინოლიზის ადგილების რაოდენობით და მათი სივრცითი ხელმისაწვდომობით, ამინომჟავების თანმიმდევრობის ჰიდროფობიურობის ხარისხით (ჰიდროფობიური და ჰიდროფილური ამინომჟავების თანაფარდობა), რომლებიც კოვალენტურად იმობილიზებულ იქნა. AFM ჩიპის ზედაპირზე ანალიტიკური ხსნარიდან (ცხრილი 1). ამ ექსპერიმენტებში გამოიყენეს AFM ჩიპები, რომლებიც შეიცავდნენ სამუშაო და საკონტროლო ზონებს. სამუშაო ზონა იყო AFM ჩიპის ზედაპირის ქიმიურად "გააქტიურებული" ტერიტორია, რომელზედაც მოხდა მოდელის ცილების "ქიმიური თევზაობა"; საკონტროლო ზონა იყო ჩიპის ზედაპირის ქიმიურად არააქტიური ტერიტორია. ვიზუალურად დატყვევებული მოლეკულების რაოდენობა ჩაწერილია AFM– ის გამოყენებით. AFM ანალიზის ექსპერიმენტული მონაცემები მიღებული ზემოთ მოყვანილი ცილებისთვის, კერძოდ AFM ჩიპის სამუშაო ფართობის ზედაპირზე დაჭერილი მოლეკულების რაოდენობა მოცემულია ცხრილში 2. სვეტი "ცილის მოლეკულების კონცენტრაცია ხსნარში" ცხრილი 2 შეიცავს მონაცემებს ანალიზის ხსნარში შესაბამისი ცილის მინიმალური ჩაწერილი კონცენტრაციის შესახებ.

როგორც ცხრილი 2 -დან ჩანს, მოლეკულების რაოდენობა რეგისტრირებული AFM ​​ჩიპის სამუშაო უბანში ყველა წარმოდგენილი ცილისთვის იყო -1040 მოლეკულა. MS დეტექტორების მგრძნობელობის ზღვარი არის დაახლოებით 105 მოლეკულა. ამრიგად, წარმოდგენილი ცილების მოდელისთვის განხორციელდა წარმატებული შეუქცევადი იმობილიზაცია AFM ჩიპის ზედაპირზე და AFM გამოვლენილი ცილოვანი ობიექტების რაოდენობა საკმარისი იყო შემდგომი MS იდენტიფიკაციისათვის. ამავდროულად, მოდელის ცილების მინიმალური დაფიქსირებული ინკუბაციის ხსნარში იყო საკმაოდ დაბალი 10 "-10" მ.

ნიმუშების მასობრივი სპექტრომეტრული ანალიზი ჩატარდა MALDI და ESI ტიპის იონიზაციის გამოყენებით. AFM ჩიპი ინკვიდირების შემდეგ ავიდინის შესაბამის ხსნარში 10'9 მ კონცენტრაციით. ამ სპექტრის ანალიზმა შესაძლებელი გახადა ავიდინის (Gallus Gallus) საიმედოდ იდენტიფიცირება მისი ორი პროტეოტიპული პეპტიდით: SSVNDIGDDWK (მ / ზ = 618.6) და VGINIFTR (მ / ზ = 460.4). ორივე პეპტიდს ჰქონდა ორმაგად დამუხტული იონების (MS სპექტრი) კარგად გამოხატული მწვერვალები. AFM-MS ანალიზი AFM ​​ჩიპის ქიმიურად გააქტიურებული სამუშაო ზონის ანალიზის შემცველი ცილის ხსნარში ინკუბაციის შემდეგ 10-8 მ კონცენტრაციამ გამოავლინა კიდევ ერთი მცირე ცილა - ტროპონინი I. MS და MS / MS სპექტრები, რომლებიც შეესაბამება პეპტიდის ორმაგად დამუხტულ იონ 1449 Da ნაჩვენებია ნახატზე 3. ექსპერიმენტულად მიღებული სპექტრის MS ანალიზმა შესაძლებელი გახადა საიმედოდ გამოვლენა და დაადგინეთ ადამიანის ტროპონინი (gi 2460249) AFM ჩიპის ზედაპირზე 95% -ზე მეტი ალბათობით ...

სურათი 5 გვიჩვენებს გლობულური ცილის, ადამიანის შრატის ალბუმინის (HSA) ტანდემური ფრაგმენტაციის სპექტრს, რომელიც ასრულებს სატრანსპორტო ფუნქციებს სისხლის პლაზმაში. სპექტრები მიღებული იქნა AFM ჩიპის ქიმიურად გააქტიურებული სამუშაო ადგილიდან ალბუმინის შესაბამის ხსნარში ინკუბაციის შემდეგ 10'9 მ კონცენტრაციით. ამ სპექტრის ანალიზმა შესაძლებელი გახადა ადამიანის ალბუმინის საიმედოდ იდენტიფიცირება მისი ორი პროტეოტიპული პეპტიდით : VPQVSTPTLVEVSR (m / z = 756.5) და YLYEIAR (m / z = 464.3) ორივე პეპტიდს ჰქონდა ორმაგად დამუხტული იონების (MS სპექტრი) კარგად გამოხატული მწვერვალები.

ტრიპსინიზირებული ობიექტების MS / MS სპექტრი AFM ​​ჩიპის ქიმიურად გააქტიურებული ზედაპირიდან, ინკუბაცია ადამიანის შრატის ალბუმინის ხსნარში (C = 10 9 მ). VPQVSTPTLVEVSR პეპტიდი m / z = 756.5 (A), YLYEIAR პეპტიდი m / z = 464.3 (B). ექსპერიმენტული პირობები: გაზომვები განხორციელდა LC / MSD Trap XCT ულტრა მასის სპექტრომეტრზე (Agilent).

ამრიგად, MS ანალიზმა შესაძლებელი გახადა AFM– ით გამოვლენილი ცილების იდენტიფიცირება. მიღებული მონაცემების საფუძველზე გამოვლინდა ურთიერთობა AFM ჩიპის ზედაპირზე გამოვლენილი პროტეოტიპური პეპტიდების რაოდენობასა და ანალიზის ხსნარში სასურველი ცილის შემცველობას შორის. ასეთი დამოკიდებულება, მაგალითად, P450 VMZ და HSA ცილების კოვალენტურად იმობილიზებული AFM ​​ჩიპის ქიმიურად გააქტიურებულ ზედაპირზე, ნაჩვენებია ფიგურაში 6. როგორც მე –6 სურათზე ჩანს, რაც უფრო მაღალია ცილის კონცენტრაცია ანალიტიკურ ხსნარში ( -KG6 M), რაც უფრო მეტია პეპტიდების რაოდენობა, შესაძლებელია საიმედოდ გამოვლენა როგორც MALDI-MS, ასევე ESI-MS ანალიზის შემთხვევაში. არ იყო მნიშვნელოვანი განსხვავებები გამოვლენილი პეპტიდების რაოდენობას შორის 10 "6-10" 9 M კონცენტრაციულ დიაპაზონში ანალიზებულ ხსნარში გაანალიზებულ ცილებს შორის.

ანალიზის მოლეკულების გამოვლენილი პეპტიდების რაოდენობის დამოკიდებულება ინკუბაციის ხსნარში ცილის კონცენტრაციაზე. (A) - მოდელის ცილების პეპტიდების ნარევის ანალიზი HSA, VMZ მასის სპექტრომეტრებზე MALDI ტიპის იონიზაციით Bruker Microflex (Bruker Daltonics, Germany) და Autoflex III (Bruker Daltonics, Germany); (ბ) მოდელის ცილების პეპტიდების ნარევის ანალიზი HSA, VMZ მასის სპექტრომეტრზე ESI ტიპის იონიზაციით LC / MSD Trap ХСТ Ultra (Agilent, აშშ).

მიღებულმა შედეგებმა მოგვცა საშუალება დავასკვნათ, რომ AFM-MS (MALDI და ESI) შესაძლებელს ხდის აღმოაჩინოს და დაადგინოს ცილის მოლეკულები კოვალენტურად დაჭერილი ანალიტიკური ხსნარიდან AFM ჩიპის ზედაპირზე, რომლებიც განსხვავდება მათ ფიზიკოქიმიურ თვისებებში.

ამავდროულად, AFM ჩიპის საკონტროლო ზონაში (არ გააქტიურებულია) ანალიზის ხსნარში ინკუბაციის შემდეგ, AFM მეთოდი არ დაარეგისტრირებს ობიექტების არსებობას ჩიპის ზედაპირზე, რომელიც შეესაბამება ცილის მოლეკულებს სიმაღლეში. MS ანალიზმა ასევე არ გამოავლინა ცილოვანი ობიექტები. ამრიგად, ექსპერიმენტულად დადასტურდა, რომ AFM ადეკვატურად აღრიცხავს სასურველ ობიექტებს - ანალიზის ცილის მოლეკულებს.

ამ სამუშაოს შემდეგი ეტაპი იყო AFM-MS კომბინირებული სქემის შემუშავება ხსნარიდან ამოღებული ცილების იდენტიფიცირებისათვის. ბიოსპეციფიკური ურთიერთქმედების ანგარიში.

მასობრივი სპექტრომეტრული ანალიზის ჩატარების სქემა - ხსნარში ცილების ბიოსპეციფიკური AFM ​​თევზჭერის შემთხვევაში ნაჩვენებია ნახაზზე 7. ზემოაღნიშნული სქემის მიხედვით, ზონდის მოლეკულების პირველი იმობილიზაცია განხორციელდა სამუშაო ფართობის ზედაპირზე AFM ჩიპები, რომლებიც იყო მონოკლონური 1 ანტისხეულები ვირუსული ჰეპატიტის B და C ცილების მარკერების წინააღმდეგ ან აფთამერები აივ -1 გლიკოპროტეინის gpl20 და თრომბინის ცილების წინააღმდეგ, ხოლო საკონტროლო ზონის ზედაპირი არ შეიცავდა იმობილიზებული ზონდის მოლეკულებს. ზონდის მოლეკულების იმობილიზაციის ხარისხის კონტროლი განხორციელდა AGM ვიზუალიზაციით. შემდეგ ასეთი ჩიპი ინკუბირებული იყო შესანახი ცილის შემცველი ანალიზის ხსნარში. ჩიპის ზედაპირზე არასპეციფიკურად შეწოვილი მოლეკულების ჩამორეცხვის შემდეგ და AFM ჩიპის ზედაპირზე შემდგომი მასობრივი სპექტრომეტრული ანალიზისათვის ნიმუშის მომზადების ეტაპის შემდეგ, AFM- ის გამოვლენილი ცილების MS ანალიზი ჩატარდა.

ამ განყოფილების ექსპერიმენტული ნაწილი მოიცავს ანალიზის ორ ეტაპს. პირველ ეტაპზე, აუცილებელი იყო AFM ჩიპზე კოვალენტურად იმობილიზებული ცილის გამოძიების მოლეკულების MS იდენტიფიკაცია, ხოლო მეორე ეტაპზე ბიო სპეციფიკური ურთიერთქმედებების გამო ხსნარიდან ან სისხლის შრატის ნიმუშებიდან დაჭერილი სამიზნე ცილები. რა ამისათვის ჩვენ ჩავატარეთ MS ანალიზი MCA AFM ჩიპების ზედაპირზე კოვალენტურად იმობილიზებული HCV და HBV მარკერის ცილების წინააღმდეგ: ანტი- HCVcore და ანტი- HBVcore. MCA- ს საწინააღმდეგო HCVcore და anti-HBVcore პროტეინების წინააღმდეგ, ტანდემური ფრაგმენტაციის სპექტრი და პეპტიდური რუქის სპექტრი პირველად იქნა მიღებული ამ ნაშრომში.

წიგნი არის პირველი სახელმძღვანელო რუსულ ენაზე ცილებისა და პეპტიდების მასობრივი სპექტრომეტრიის საფუძვლების შესახებ. ამ პუბლიკაციის მიზანია ახალგაზრდა მკვლევარების დაინტერესება ინფორმაციული, ლამაზი და მოთხოვნადი დისციპლინით მთელს მსოფლიოში, რათა შესაძლებელი გახდეს მასობრივი სპექტრომეტრიის უფრო ეფექტური გამოყენება ფუნდამენტური და გამოყენებითი სამეცნიერო პრობლემების გადასაჭრელად. წიგნი დაწერილია დამწყებთათვის ლექციის ფორმატში, კარგად ილუსტრირებული და თან ახლავს ციტირებული ლიტერატურის წარმომადგენლობითი სია.

პუბლიკაცია განკუთვნილია ქიმიური, ფიზიკურ-ქიმიური, ბიოლოგიური და სამედიცინო სპეციალობების ბაკალავრიატისა და მაგისტრატურის სტუდენტებისთვის; სასარგებლო იქნება მკვლევარებისთვის, რომლებიც უკვე მუშაობენ ცილისა და პეპტიდების კვლევის სფეროში ან დაინტერესებულნი არიან ამ სამეცნიერო მიმართულებით.

წინასიტყვაობა

ეძღვნება
ქიმიის ფაკულტეტის პროფესორები
მოსკოვის სახელმწიფო უნივერსიტეტი მ.ვ. ლომონოსოვი
ალექსანდრე ლეონიდოვიჩ კურცი
კიმ პეტროვიჩ ბუტინი

მასობრივი სპექტრომეტრიის ყველაზე მნიშვნელოვანი მიღწევები ბოლო 20 წლის განმავლობაში დაკავშირებულია ბუნებრივი ნაერთების შესწავლასთან, მათ შორის ბიოპოლიმერებთან. ელექტრო სპრეის იონიზაციის და მატრიცის დახმარებით ლაზერული დესორბცია / იონიზაცია, შაქარი, ნუკლეინის მჟავები, ცილები, ლიპიდები და სხვა ბიოორგანული მაკრომოლეკულები ხელმისაწვდომი გახდა მასის სპექტრომეტრიისთვის. ჯერჯერობით უდიდესი მიღწევაა ცილების შესწავლაში. მისი მგრძნობელობის, ინფორმაციული შინაარსის, ექსპრესიულობის, ნარევებთან მუშაობის უნარის გამო, მასობრივი სპექტრომეტრია დღეს არის მთავარი მეთოდი ამ ობიექტების გასაანალიზებლად, რომელთა შესწავლა რთულია.

ალბათ, შეიძლება აღიარებული იყოს, რომ თანამედროვე მასის სპექტრომეტრიამ მოიგო კონკურსი ედმანის მიხედვით პეპტიდებში ამინომჟავების პირველადი თანმიმდევრობის დადგენის კლასიკური მეთოდით, ვინაიდან მასობრივი სპექტრომეტრული თანმიმდევრობა აღმოჩნდა ბევრად უფრო სწრაფი, უფრო მგრძნობიარე, უფრო ინფორმაციული და კიდევ უფრო იაფი. ცილების პირველადი სტრუქტურის სწრაფი და საიმედო განსაზღვრა, ე.ი. ამინომჟავების თანმიმდევრობა უკვე თავისთავად შესანიშნავი შედეგია. ამასთან, მასის სპექტრომეტრიას შეუძლია შეისწავლოს უფრო რთული სტრუქტურების სტრუქტურა (2-დან 4-მდე), მათ შორის ცილების არაკოვალენტური ურთიერთქმედება ზე-ცილოვანი წარმონაქმნების გამოჩენით, დაადგინოს პოსტ-თარგმანის მოდიფიკაციების ტიპი და ადგილი, გლიკოპროტეინებთან მუშაობა , ლიპოპროტეინები, ფოსფოპროტეინები და სხვ. მასობრივი სპექტრომეტრია შეუცვლელი გახდა მედიცინაში, რადგან მას შეუძლია სწრაფად და საიმედოდ განსაზღვროს გულ -სისხლძარღვთა, გენეტიკური და ონკოლოგიური დაავადებები. სწორედ მასობრივი სპექტრომეტრიის წარმატებებმა განაპირობა გასული საუკუნის ბოლოს ახალი სამეცნიერო მიმართულების - პროტეომიკის ჩამოყალიბება. მეთოდის როლი მეტაბოლიზმში ასევე უზარმაზარია.

სამწუხაროდ, რუსულენოვან ლიტერატურაში ჯერ არ ყოფილა სახელმძღვანელოები ან მონოგრაფიები ამ ყველაზე მნიშვნელოვანი და მრავალმხრივი თემის შესახებ. რუსეთი რადიკალურად ჩამორჩება განვითარებულ ქვეყნებს როგორც ამ დისციპლინის შესწავლაში, ასევე მისი მიღწევების გამოყენებაში. მასობრივი სპექტრომეტრისტები, რომლებიც მუშაობენ რუსეთში, უნდა დაეყრდნონ წიგნების, ორიგინალური სტატიებისა და მიმოხილვების ინგლისურენოვან გამოცემებს. 2012 წელს გამოქვეყნდა წიგნი "მასობრივი სპექტრომეტრიის პრინციპები, რომლებიც გამოიყენება ბიომოლეკულებზე" რუსულ ენაზე ჯ. ლასკინისა და ჰ. ლიფშიცის რედაქტორობით (ინგლისურიდან თარგმნა, გამომცემლობა "ტექნოსფერო"), რომელიც წარმოადგენს წამყვანი სტატიების კრებულს. მასის სპექტრომეტრიის ექსპერტები ბიოლოგიაში. წიგნი განკუთვნილია მომზადებული მკითხველისთვის. Ის უზრუნველყოფს

კარგი, მრავალი თვალსაზრისით, მიმოწერის შესაძლებლობა გაეცნოთ თანამედროვე მიღწევებს ბიომოლეკულების მასობრივი სპექტრომეტრიის სფეროში, რადგან მასში აღწერილი მეთოდების უმეტესობა ჯერ არ არის გამოყენებული ჩვენს ქვეყანაში.

წიგნი "ცილებისა და პეპტიდების მასობრივი სპექტრომეტრიის საფუძვლები" მკითხველებს შესთავაზა არის პირველი სახელმძღვანელო რუსულ ენაზე, რომელიც ასახავს ცილებისა და პეპტიდების მასობრივი სპექტრომეტრიის საფუძვლებს. წიგნი დაწერილია დამწყებთათვის ლექციების ფორმატში, ილუსტრირებულია დიდი რაოდენობით ფიგურებით, სპექტრებით, დიაგრამებით და თან ახლავს ციტირებული ლიტერატურის წარმომადგენლობითი სია. ის განკუთვნილია ქიმიური, ფიზიკურ-ქიმიური, ბიოლოგიური და სამედიცინო სპეციალობების ბაკალავრიატისა და მაგისტრატურის სტუდენტებისთვის; სასარგებლო იქნება მკვლევარებისთვის, რომლებიც უკვე მუშაობენ ცილისა და პეპტიდების კვლევის სფეროში ან დაინტერესებულნი არიან ამ სამეცნიერო მიმართულებით.

ასეთი წიგნის გამოცემის მიზანია ახალგაზრდა მკვლევარების დაინტერესება ინფორმაციული, ძალიან ლამაზი და მოთხოვნადი დისციპლინით მთელს მსოფლიოში, რათა შესაძლებელი გახდეს მასობრივი სპექტრომეტრიის უფრო ეფექტური გამოყენება საკუთარი ფუნდამენტური და გამოყენებითი სამეცნიერო პრობლემების გადასაჭრელად.

სახელმძღვანელოში ძირითადი ყურადღება ეთმობა ცილებისა და პეპტიდების იონიზაციის მეთოდებს, ამ ნაერთების გაყოფის პროცესებს გაზის ფაზაში. ტანდემური მასის სპექტრომეტრიის საკითხები და ფრაგმენტაციის დაწყების არსებული მეთოდები საკმარისად დეტალურად არის განხილული. ეს განყოფილება ძალზე მნიშვნელოვანია თანამედროვე მასობრივი სპექტრომეტრიაში. ის სასარგებლოა მკვლევარებისთვის, რომლებიც მუშაობენ ნებისმიერ ქიმიურ ნაერთთან და ბიოპოლიმერთან. რამოდენიმე თავი ეძღვნება ცილებისა და პეპტიდების იდენტიფიკაციას. ეს მოიცავს ავტომატური იდენტიფიკაციის ვარიანტებს, სპექტრის ხელით გაშიფვრას, მასობრივი სპექტრომეტრული თანმიმდევრობის სპეციფიკური სირთულის აღწერას და მათი დაძლევის ვარიანტებს. განიხილება ორი ძირითადი მიდგომის უპირატესობები და უარყოფითი მხარეები ცილების ქიმიური სტრუქტურის განსაზღვრისას: "ზემოდან ქვემოთ" და "ქვემოდან ზემოთ" მასის სპექტრომეტრია. ცალკე თავი ეთმობა რაოდენობრივი ანალიზის კითხვებს.

წიგნი ეძღვნება ალექსანდრე ლეონიდოვიჩ კურცს და კიმ პეტროვიჩ ბუტინს, ორ მეგობარს, მოსკოვის სახელმწიფო უნივერსიტეტის ქიმიის ფაკულტეტის გამორჩეულ პროფესორებს M.V. ლომონოსოვი, რომლებიც ჩვენთან ძალიან ახლოს არიან ადამიანური თვალსაზრისით, რომლებიც უშუალოდ მონაწილეობდნენ ჩვენს ქიმიურ და ჰუმანიტარულ განათლებაში. ჩვენ ყოველთვის ვაფასებდით ამ მეცნიერთა ქიმიურ ერუდიციას და საოცარ პიროვნულ თვისებებს. სწორედ ამ ადამიანებთან ურთიერთობა იყო შთაგონება 21 -ე საუკუნის დასაწყისში, რომ დავიწყოთ კვლევა პეპტიდების მასობრივი სპექტრომეტრიის სფეროში.

ა.ტ. ლებედევი
კ.ა. არტემენკო
T.Yu. სამგინა

დამარილება: ნალექები ტუტე მარილებით, ტუტე დედამიწის ლითონებით (ნატრიუმის ქლორიდი, მაგნიუმის სულფატი), ამონიუმის სულფატი; ცილის პირველადი სტრუქტურა არ არის დარღვეული;

დანალექი: გამომშრალი ნივთიერებების გამოყენება: ალკოჰოლი ან აცეტონი დაბალ ტემპერატურაზე (დაახლოებით –20 С).

ამ მეთოდების გამოყენებისას ცილებს მოკლებულია ჰიდრატაციის გარსი და ილექება ხსნარში.

დენატურაციაცილების სივრცითი სტრუქტურის დარღვევა (მოლეკულის პირველადი სტრუქტურა დაცულია). ის შეიძლება შექცევადი იყოს (ცილის სტრუქტურა აღდგება დენატურირების აგენტის მოცილების შემდეგ) ან შეუქცევადი (მოლეკულის სივრცითი სტრუქტურა არ აღდგება, მაგალითად, როდესაც ცილები ილექება კონცენტრირებული მინერალური მჟავებით, მძიმე მეტალის მარილებით).

ცილების გამოყოფის მეთოდები ცილების გამოყოფა დაბალი მოლეკულური წონის მინარევებისაგან

დიალიზი

გამოიყენება სპეციალური პოლიმერული მემბრანა, რომელსაც აქვს გარკვეული ზომის პორები. მცირე მოლეკულები (დაბალი მოლეკულური წონის მინარევები) გადის მემბრანის ფორებში, ხოლო დიდი (ცილები) შენარჩუნებულია. ამრიგად, ცილები გარეცხილია მინარევებისაგან.

ცილების გამოყოფა მოლეკულური წონის მიხედვით

ლარი ქრომატოგრაფია

ქრომატოგრაფიული სვეტი ივსება გელის მძივებით (სეფადექსი), რომელსაც აქვს გარკვეული ზომის ფორები. ცილების ნარევი ემატება სვეტს. ცილები, რომელთა ზომა უფრო მცირეა ვიდრე სეფადექსის ფორების ზომა, ინახება სვეტში, რადგან ისინი "იჭერენ" ფორებში, დანარჩენი კი თავისუფლად ტოვებენ სვეტს (სურ. 2.1). ცილის ზომა დამოკიდებულია მის მოლეკულურ წონაზე.

ბრინჯი 2.1ცილების გამოყოფა გელის ფილტრაციით

ულტრაცენტრიფუგაცია

ეს მეთოდი ემყარება ცილების მოლეკულების დალექვის (დალექვის) სხვადასხვა სიჩქარეს სხვადასხვა სიმკვრივის გრადიენტის მქონე ხსნარებში (საქაროზის ბუფერი ან ცეზიუმის ქლორიდი) (სურ. 2.2).

ბრინჯი 2.2.ცილების გამოყოფა ულტრაცენტრიფუგირებით

ელექტროფორეზი

ეს მეთოდი ემყარება ცილებისა და პეპტიდების მიგრაციის სხვადასხვა სიჩქარეს ელექტრულ ველში, მუხტის მიხედვით.

ელექტროფორეზის მატარებლები შეიძლება იყოს გელები, ცელულოზის აცეტატი, აგარი. მოლეკულები, რომლებიც განცალკევებულია, მოძრაობენ გელში მათი ზომის მიხედვით: ის, რაც უფრო დიდია, შენარჩუნდება გელის პორებში გავლისას. მცირე ზომის მოლეკულები შეხვდებიან ნაკლებ წინააღმდეგობას და, შესაბამისად, უფრო სწრაფად მოძრაობენ. შედეგად, ელექტროფორეზის შემდეგ, უფრო დიდი მოლეკულები უფრო ახლოს იქნება საწყისთან, ვიდრე პატარაები (სურ. 2.3).

ბრინჯი 2.3... ცილების გამოყოფა გელის ელექტროფორეზით

ცილები შეიძლება გამოყოფილი იყოს მოლეკულური მასით ელექტროფორეზის საშუალებით.ამისათვის გამოიყენეთ ელექტროფორეზი PAGE- ში ნატრიუმის დოდეცილ სულფატის (DDS-Na) თანდასწრებით.

ცალკეული ცილების გამოყოფა

მიახლოებითი ქრომატოგრაფია

მეთოდი ემყარება ცილების უნარს მტკიცედ დაუკავშირონ სხვადასხვა მოლეკულებს არაკოვალენტური ობლიგაციებით. იგი გამოიყენება ფერმენტების, იმუნოგლობულინების, რეცეპტორული ცილების გამოყოფისა და გასაწმენდად.

ნივთიერებების მოლეკულები (ლიგანდები), რომლებთანაც გარკვეული ცილები სპეციალურად არის შეკრული, კოვალენტურად არის დაკავშირებული ინერტული ნივთიერების ნაწილაკებთან. ცილების ნარევი შემოდის სვეტში და სასურველი ცილა მტკიცედ არის მიმაგრებული ლიგანდთან. დანარჩენი ცილები თავისუფლად ტოვებს სვეტს. შემორჩენილი ცილა შეიძლება გარეცხილი იყოს სვეტიდან ბუფერული ხსნარით, რომელიც შეიცავს ლიგანდს. ეს უაღრესად მგრძნობიარე მეთოდი საშუალებას იძლევა ძალიან მცირე რაოდენობით ცილის იზოლირება სუფთა სახით უჯრედის ექსტრაქტიდან, რომელიც შეიცავს ასობით სხვა ცილას.

იზოელექტრული ფოკუსირება

მეთოდი ემყარება ცილების IEP- ის სხვადასხვა მნიშვნელობებს. ცილები გამოყოფილია ელექტროფორეზით ამფოლინით ფირფიტაზე (ეს არის ნივთიერება, რომელსაც აქვს წინასწარ ჩამოყალიბებული pH გრადიენტი 3-დან 10-მდე დიაპაზონში). ელექტროფორეზის დროს ცილები გამოყოფილია მათი IEP- ის მნიშვნელობის შესაბამისად (IEP- ში ცილის მუხტი იქნება ნული და ის არ გადაადგილდება ელექტრულ ველში).

2D ელექტროფორეზი

ეს არის იზოელექტრული ფოკუსირებისა და ელექტროფორეზის კომბინაცია SDS-Na– სთან. პირველი, ელექტროფორეზი ხორციელდება ჰორიზონტალური მიმართულებით ფირფიტაზე ამფოლინით. ცილები გამოყოფილია მუხტის მიხედვით (IEP). შემდეგ ფირფიტა დამუშავებულია SDS-Na ხსნარით და ელექტროფორეზი ხორციელდება ვერტიკალური მიმართულებით. ცილები გამოყოფილია მოლეკულური წონის მიხედვით.

იმუნოელექტროფორეზი (ვესტერნ ბლოტი)

ანალიტიკური მეთოდი, რომელიც გამოიყენება ნიმუშში კონკრეტული ცილების დასადგენად (სურათი 2.4).

ცილების გამოყოფა ბიოლოგიური მასალისგან.

ცილების გამოყოფა მოლეკულური წონის მიხედვით ელექტროფორეზის საშუალებით PAGE- ში SDS-Na.

ცილების გადატანა გელიდან პოლიმერულ ფირფიტაზე შემდგომი მუშაობის გასაადვილებლად.

ფირფიტის დამუშავება არასპეციფიკური ცილის ხსნარით დარჩენილი ფორების შესავსებად.

ამრიგად, ამ ეტაპის შემდეგ მიიღება ფირფიტა, რომლის ფორები შეიცავს გამოყოფილ ცილებს და მათ შორის სივრცე ივსება არასპეციფიკური ცილით. ახლა ჩვენ უნდა გავარკვიოთ არის თუ არა სასურველი ცილა ცილებს შორის, რომლებიც პასუხისმგებელნი არიან რაიმე სახის დაავადებაზე. ანტისხეულების მკურნალობა გამოიყენება გამოვლენის მიზნით. პირველადი ანტისხეულები იგულისხმება სამიზნე ცილის ანტისხეულები. მეორადი ანტისხეულები ნიშნავს პირველადი ანტისხეულების ანტისხეულებს. დამატებითი სპეციალური ეტიკეტი (ე.წ. მოლეკულური ზონდი) ემატება მეორადი ანტისხეულების შემადგენლობას, რათა შედეგების ვიზუალიზაცია მოხდეს. მარკირების სახით გამოიყენება რადიოაქტიური ფოსფატი ან ფერმენტი, რომელიც მჭიდროდ არის შეკრული მეორად ანტისხეულთან. ჯერ პირველადი და შემდეგ მეორად ანტისხეულებთან დაკავშირებას ორი მიზანი აქვს: მეთოდის სტანდარტიზაცია და შედეგების გაუმჯობესება.

პირველადი ანტისხეულების დამაკავშირებელი ხსნარით მკურნალობა ხდება იმ ფირფიტის ადგილას, სადაც არის ანტიგენი (სამიზნე ცილა).

შეუზღუდავი ანტისხეულების მოცილება (რეცხვა).

მკურნალობა ეტიკეტირებული მეორადი ანტისხეულების ხსნარით შემდგომი განვითარებისათვის.

შეუზღუდავი მეორადი ანტისხეულების მოცილება (რეცხვა).

ბრინჯი 2.4... იმუნოელექტროფორეზი (ვესტერნ ბლოტი)

ბიოლოგიურ მასალაში სასურველი ცილის არსებობის შემთხვევაში ფირფიტაზე ჩნდება ზოლები, რაც მიუთითებს ამ ცილის შეკავშირებაზე შესაბამის ანტისხეულებთან.

ცილების იდენტიფიცირების მიზნით, გამოიყენება სხვადასხვა საძიებო სისტემა EMBL და Sequest მონაცემთა ბაზებში, შემუშავებული კვლევითი ჯგუფების ფარგლებში. თუმცა, Mascot საძიებო სისტემა გახდა ცილების იდენტიფიკაციის სტანდარტი. თითქმის ყველა საძიებო სისტემის მსგავსად, ის იყენებს ვებ ინტერფეისს და საძიებო სისტემა თავად არის ინტერნეტში, მაგრამ მისი ყიდვა და დაინსტალირებაც შესაძლებელია მომხმარებლის კომპიუტერში.

მასკოტს შეუძლია იმუშაოს სხვადასხვა დანამატიანი ცილებით და გენომიკური მონაცემთა ბაზებით. ეს შეიძლება იყოს ფართო საჯარო მონაცემთა ბაზები, როგორიცაა NCBI ან SwissProt, კომერციული, ან მომხმარებლის მიერ შექმნილი.

ყველა სისტემაში იდენტიფიკაცია ხორციელდება მკვლევარის მიერ მიღებული მასობრივი სპექტრომეტრული მონაცემების მიხედვით, ცილების ცნობილ სტრუქტურებთან შედარების გზით.

იმის გათვალისწინებით, რომ ბოლო ათწლეულების განმავლობაში, ცილების თანმიმდევრობა შემცირდა, ფაქტობრივად, მათი კოდირების გენების თანმიმდევრობით, პრაქტიკაში უფრო გონივრულია ცილების იდენტიფიცირება ექსპერიმენტული მასის სპექტრომეტრული მონაცემების ცნობილი გენომებით შედარების გზით.

ცილების იდენტიფიკაციის სხვადასხვა ალგორითმი არსებობს, მაგრამ მათი შესაძლებლობები შეზღუდულია ამჟამად ცნობილი გენომებით. თუმცა, იმის გათვალისწინებით, რომ ორგანიზმები განსხვავებული ტიპებიმიუხედავად ამისა, მათ აქვთ ჰომოლოგიური ცილები, ხშირად შესაძლებელია ცილების იდენტიფიცირება უცნობი გენომის მქონე ორგანიზმებისგან.

პროტეომიული კვლევის სხვადასხვა მეთოდოლოგიური მიდგომა იძლევა ფუნდამენტურად განსხვავებულ მონაცემებს და მოითხოვს მათ გამოთვლილ მიდგომებს დამუშავებისათვის.

ყველაზე ხელმისაწვდომი და უაღრესად პროდუქტიული მეთოდია მასის სპექტრომეტრიული პეპტიდური რუქების იდენტიფიკაციის მეთოდი კონკრეტული პროტეოლიზური ჰიდროლიზისთვის. ინგლისურენოვან ლიტერატურაში იგი ცნობილია როგორც პეპტიდური მასის ანაბეჭდი (PMF). ტრიპსინი ყველაზე ხშირად გამოიყენება როგორც სპეციფიური პროტეაზა. პირველ ეტაპზე იზოლირებული ცილა (მაგალითად, ელექტროფორეზის საშუალებით) გადის პროტეოლიზურ ჰიდროლიზს. ამ ჰიდროლიზის შედეგად მიიღება პეპტიდების ნარევი. იმის გათვალისწინებით, რომ გამოიყენება უაღრესად სპეციფიკური პროტეაზა, ეს იქნება ძალიან სპეციფიკური პეპტიდების ნარევი. ასე რომ, ტრიპსინის გამოყენებისას, ცილა "დაიჭრება" არგინინსა და ლიზინში.

შემდეგი ეტაპი არის მიღებული ნარევის მასობრივი სპექტრის რეგისტრაცია. შედეგი არის მოლეკულური წონის კომპლექტი ან სია. ის არ იძლევა ინფორმაციას პროდუქტის სტრუქტურის ან სხვა თვისებების შესახებ, მეთოდი ემყარება მხოლოდ იმ ვარაუდს, რომ ეს არის პეპტიდების მოლეკულური წონა და ეს პეპტიდები წარმოიქმნა კონკრეტული ჰიდროლიზის შედეგად. სწორედ აქ იმალება მიდგომის მთავარი იდეა - თუ თითოეულ ცილას აქვს თავისი პეპტიდების ნაკრები და მოლეკულური წონის შესაბამისი სია, მაშინ სავსებით შესაძლებელია შებრუნებული პრობლემის გადაჭრა - შესაბამისი ცილის პოვნა ამის შედეგად მოლეკულური წონის ჩამონათვალი. და ასეთი პრობლემა მართლაც ხშირად წყდება.

კერძოდ, ეს საშუალებას გაძლევთ გააკეთოთ თილისმა.