एक परमाणु बल माइक्रोस्कोप अन्ना लियोनिदोवना कैशेवा के चिप्स पर प्रोटीन और प्रोटीन परिसरों की मास स्पेक्ट्रोमेट्रिक पहचान। प्रोटीन के भौतिक रासायनिक गुण। प्रोटीन शुद्धि और पहचान के तरीके प्रोटीन पहचान के तरीके

शीर्षक

प्रोटीन का अलगाव और शुद्धिकरण चरणों में किया जाता है।

1. समरूपीकरण- यह जैव रासायनिक अनुसंधान की वस्तुओं को एक सजातीय, यानी सजातीय अवस्था में पूरी तरह से पीसना है, अर्थात कोशिका की दीवार के विनाश तक प्रोटीन पूरी तरह से विघटन से गुजरते हैं।
इस मामले में, वे उपयोग करते हैं:
लेकिन)वारिंग जैसे चाकू होमोजेनाइज़र;
बी)स्त्रीकेसर होमोजेनाइज़र पॉटर - एल्वेजिमा;
में)गेंद और रोलर मिल - सघन वस्तुओं के लिए;
जी)बारी-बारी से ठंड और विगलन की विधि, जबकि कोशिका भित्ति का टूटना बर्फ के क्रिस्टल की क्रिया के तहत होता है;
इ)"नाइट्रोजन बम" विधि - उच्च दबाव में, कोशिकाओं को नाइट्रोजन से संतृप्त किया जाता है, फिर दबाव तेजी से गिराया जाता है, गैसीय नाइट्रोजन निकलता है, जो कि अंदर से सेल को विस्फोट करता है;
इ)अल्ट्रासाउंड, विभिन्न प्रेस विधियां, एंजाइमों के साथ कोशिका भित्ति का पाचन। ज्यादातर मामलों में, होमोजेनाइजेशन के दौरान गर्मी उत्पन्न होती है, जबकि कई प्रोटीन निष्क्रिय हो सकते हैं, इसलिए सभी प्रक्रियाएं ठंडे कमरे में t 0 पर की जाती हैं या कच्चे माल को बर्फ से ठंडा किया जाता है। इसी समय, सेल विनाश की मात्रा और समय, काम के दबाव को सावधानीपूर्वक नियंत्रित किया जाता है। आदर्श एक समरूप उत्पाद है जो आगे निष्कर्षण से गुजर सकता है।

2. प्रोटीन का निष्कर्षण, अर्थात्, भंग अवस्था में उनका अनुवाद; सबसे अधिक बार, निष्कर्षण एक ही समय में पीसने के साथ-साथ किया जाता है।

निष्कर्षण किया जाता है:
लेकिन) 8-10% नमक के घोल में घोलना;
बी)अम्लीय से थोड़ा क्षारीय (बोरेट, फॉस्फेट, साइट्रेट, ट्रिस - बफर: NH2 - CH3 + HCl के साथ ट्राइसामिनोमेथेन का मिश्रण) के साथ बफर समाधान का उपयोग करना;
में)कार्बनिक सॉल्वैंट्स (इथेनॉल, मेथनॉल, ब्यूटेनॉल, एसीटोन और उनके संयोजन) के साथ प्रोटीन की वर्षा, जबकि प्रोटीन-लिपिड और प्रोटीन-प्रोटीन घटकों का क्षरण होता है, यानी ChSB का विनाश।

3. प्रोटीन की शुद्धि और विभाजन।निष्कर्षण के बाद, मिश्रण को अलग-अलग प्रोटीनों में अलग या विभाजित किया जाता है और उनका आगे शुद्धिकरण किया जाता है:

ए) नमकीन बनानाक्षार और क्षारीय पृथ्वी धातुओं के तटस्थ नमक समाधान के साथ प्रोटीन की वर्षा की एक प्रक्रिया है।

नमकीन बनाना तंत्र- जोड़े गए आयन और धनायन प्रोटीन के हाइड्रेटेड प्रोटीन शेल को नष्ट कर देते हैं, जो प्रोटीन समाधानों की स्थिरता के कारकों में से एक है। सबसे अधिक इस्तेमाल किए जाने वाले समाधान ना और अमोनियम सल्फेट हैं। कई प्रोटीन जलयोजन खोल के आकार और आवेश के परिमाण में भिन्न होते हैं। प्रत्येक प्रोटीन का अपना नमकीन-बाहर क्षेत्र होता है। साल्टिंग-आउट एजेंट को हटाने के बाद, प्रोटीन अपनी जैविक गतिविधि और भौतिक रासायनिक गुणों को बरकरार रखता है। नैदानिक ​​​​अभ्यास में, ग्लोब्युलिन को अलग करने के लिए सॉल्टिंग-आउट विधि का उपयोग किया जाता है (जब अमोनियम सल्फेट (NH 4) 2SO 4 का 50% घोल जोड़ा जाता है, तो एक अवक्षेप बनता है) और एल्ब्यूमिन (जब अमोनियम सल्फेट (NH) का 100% समाधान होता है। 4) 2SO4 जोड़ा जाता है, एक अवक्षेप बनता है)।

नमकीन आउट मूल्य इससे प्रभावित होता है:
1) नमक की प्रकृति और एकाग्रता;
2) पीएच-पर्यावरण;
3) तापमान।

इस मामले में, आयनों की संयोजकता मुख्य भूमिका निभाती है। इसलिए, नमक के प्रभाव का मूल्यांकन समाधान μ की आयनिक शक्ति द्वारा किया जाता है:

, अर्थात्, विलयन की आयनिक शक्ति (μ) प्रत्येक आयन (C) की सांद्रता के ½ के गुणनफल के बराबर होती है, जो इसकी संयोजकता (V) के वर्ग द्वारा होती है।

कोहन की विधि एक प्रकार का नमकीन बनाना है। घटकों का निष्कर्षण और वर्षा एक ही समय में होती है। क्रमिक रूप से तापमान (आमतौर पर कम t o -0 + 8 o C), घोल का pH और सांद्रित इथेनॉल, 18 प्रोटीन अंश तक क्रमिक रूप से रक्त प्लाज्मा से अलग किया जाता है।

कोहन की विधिरक्त के विकल्प के उत्पादन के लिए दवा उत्पादन में उपयोग किया जाता है;
बी) क्रोमैटोग्राफिक तरीके... रूसी वैज्ञानिक मिखाइल त्सवेट (1903) को क्रोमैटोग्राफिक विश्लेषण विधियों के विकास का संस्थापक माना जाता है। वर्तमान में, इसकी कई किस्में हैं। यह विधि पदार्थों की क्षमता पर आधारित है जो विशेष रूप से एक स्तंभ में संलग्न या एक वाहक पर रखे गए एक सोखना पर सोखना है। इस मामले में, एनालिटिक्स को अलग किया जाता है और कड़ाई से परिभाषित सोखना परत में केंद्रित किया जाता है। फिर, स्तंभ के माध्यम से उपयुक्त एलुएंट्स (सॉल्वैंट्स) पारित किए जाते हैं, जो सोखना की ताकतों को कमजोर करते हैं और स्तंभ से सोखने वाले पदार्थों को धोते हैं। अंश संग्राहक में पदार्थ एकत्र किए जाते हैं।

क्रोमैटोग्राफी में मौलिक है वितरण अनुपात, जो पदार्थ की सांद्रता के अनुपात के बराबर है मोबाइल फेज़में पदार्थ की एकाग्रता के लिए स्थैतिक चरण(या स्थैतिक चरण).

स्थिर स्थिर चरण- ठोस या तरल हो सकता है, या ठोस और तरल का मिश्रण हो सकता है।

मोबाइल फेज़- तरल या गैसीय, यह एक स्थिर पर बहता है, या इसके माध्यम से पारित किया जाता है।

स्थिर और गतिशील प्रावस्था के प्रकार के आधार पर, वर्णलेखी विश्लेषण के विभिन्न संशोधन होते हैं।

सोखना- अधिशोषक द्वारा प्रोटीनों के अधिशोषण की विभिन्न डिग्री और उपयुक्त विलायक में उनकी विलेयता पर आधारित।

एप्लाइड adsorbents - सिलिकिक एसिड, अल 2 ओ 3, सीएसीओ 3, एमजीओ, चारकोल। एक विलायक (आमतौर पर एक बफर समाधान के साथ) के साथ निलंबन के रूप में सोखना एक कॉलम (कांच की ऊर्ध्वाधर ट्यूब) में पैक किया जाता है। नमूना को स्तंभ पर लागू किया जाता है, फिर एक विलायक या सॉल्वैंट्स का मिश्रण इसके माध्यम से पारित किया जाता है।

विभाजन इस तथ्य पर आधारित है कि उच्च K वितरण वाले पदार्थ। (बी) एक उच्च गति से कॉलम के साथ आगे बढ़ें। भिन्न संग्राहक का उपयोग करके भिन्नों का संग्रह किया जाता है।

विभाजन क्रोमैटोग्राफी- दो तरल चरणों के बीच प्रोटीन के मिश्रण के वितरण के आधार पर। पृथक्करण विशेष क्रोमैटोग्राफिक पेपर के साथ-साथ कॉलम में भी हो सकता है, जैसे सोखना पेपर में। इस मामले में ठोस चरण केवल तरल स्थिर चरण के समर्थन के रूप में कार्य करता है। क्रोमैटोग्राफिक पेपरइसके सेल्यूलोज फाइबर के बीच पानी बनाए रखने की संपत्ति है। यह जल एक स्थिर स्थिर अवस्था है। जब एक गैर-जलीय विलायक (मोबाइल चरण) केशिका बलों की कार्रवाई के तहत कागज पर चलता है, तो कागज पर लागू पदार्थ के अणुओं को उनके वितरण गुणांक के अनुसार दो चरणों के बीच वितरित किया जाता है। गतिशील प्रावस्था में किसी पदार्थ की विलेयता जितनी अधिक होगी, वह विलायक के साथ कागज के साथ उतना ही आगे बढ़ेगा।
एक स्तंभ पर क्रोमैटोग्राफी वितरण के मामले में, वाहक सेलूलोज़, स्टार्च, सिलिका जेल, आदि हैं, स्थिर चरण पानी है। जब स्तंभ पर लागू किया जाता है, तो मिश्रण अलग-अलग गति से स्तंभ के साथ-साथ चलते हैं, क्रासप्र को ध्यान में रखते हुए।

मानक परिस्थितियों में प्रत्येक यौगिक के लिए आरएफ स्थिर है।
आयन एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी - विपरीत आवेशित कणों के आकर्षण पर आधारित। इसके लिए, विभिन्न आयन-एक्सचेंज रेजिन का उपयोग किया जाता है: कटियन-एक्सचेंज रेजिन - में नकारात्मक चार्ज किए गए समूह होते हैं - सल्फोनेटेड स्टाइरीन और सीएमसी, जो जांच किए गए पदार्थों के सकारात्मक चार्ज आयनों को आकर्षित करते हैं। उन्हें एसिड आयन एक्सचेंजर्स भी कहा जाता है।
आयनों एक्सचेंज रेजिन, या बुनियादी आयन एक्सचेंजर्स में सकारात्मक चार्ज किए गए समूह होते हैं जो नकारात्मक चार्ज प्रोटीन अणुओं को आकर्षित करते हैं
ट्राइमेथिलैमिनोस्टिरोल स्टाइरीन और सेल्युलोज का व्युत्पन्न है।
अलग किए जाने वाले प्रोटीन के q के आधार पर, उपयुक्त आयन एक्सचेंजर्स का उपयोग किया जाता है, जिसके साथ कुछ प्रोटीन परस्पर क्रिया करते हैं, जबकि अन्य स्वतंत्र रूप से कॉलम छोड़ देते हैं। स्तंभ पर "अवक्षेपित" प्रोटीन अधिक केंद्रित खारा समाधान का उपयोग करके या एलुएंट के पीएच को बदलकर हटा दिए जाते हैं।
एफ़िनिटी क्रोमैटोग्राफी (या एफ़िनिटी क्रोमैटोग्राफी) प्रोटीन या अन्य मैक्रोमोलेक्यूल्स की चयनात्मक बातचीत के सिद्धांत पर आधारित है, जो वाहकों पर स्थिर विशिष्ट पदार्थों के साथ होती है - लिगैंड्स (यह एक कोएंजाइम हो सकता है, अगर एक एंजाइम अलग है, एक एंटीबॉडी एक एंटीजन है, आदि। केवल मिश्रण से एक प्रोटीन परिवर्तित पीएच या परिवर्तित आयनिक शक्ति के साथ बफर मिश्रण से धोया जाता है।
लाभ उच्च शुद्धता के किसी दिए गए पदार्थ को एक चरण में अलग करने की क्षमता है।
जेल निस्पंदन या आणविक चलनी विधि एक प्रकार का पारगमन क्रोमैटोग्राफी है।
आकार और आकार के आधार पर अणुओं का पृथक्करण आणविक चलनी गुणों पर आधारित होता है जो कई झरझरा सामग्री में होते हैं, जैसे कि कार्बनिक पॉलिमर एक त्रि-आयामी नेटवर्क संरचना के साथ जो उन्हें जैल के गुण देता है। जेल निस्पंदन आणविक आकार (Sepharose, Sephadex, Sephacryl, biogels, आदि) में अंतर के आधार पर जैल का उपयोग करके पदार्थों का पृथक्करण है। एपिक्लोरोहाइड्रिन की कार्रवाई के तहत, डेक्सट्रान (सूक्ष्मजीवों द्वारा संश्लेषित) की पॉलीसेकेराइड श्रृंखलाएं एक नेटवर्क संरचना में क्रॉसलिंक की जाती हैं, पानी में अघुलनशील हो जाती हैं, लेकिन इसके लिए एक महान आत्मीयता बनाए रखती हैं। इस हाइड्रोफिलिसिटी के कारण, परिणामी अनाज (जिसे सेफैडेक्स कहा जाता है) एक जेल बनाने के लिए दृढ़ता से सूज जाता है जो स्तंभ में भर जाता है। विधि इस तथ्य पर आधारित है कि बड़े अणु आंतरिक जलीय चरण में प्रवेश नहीं करते हैं, जबकि छोटे अणु पहले "छलनी" के छिद्रों में प्रवेश करते हैं, जैसे कि उनमें फंस जाते हैं, और इसलिए कम गति से चलते हैं। तदनुसार, उच्च मिस्टर वाले प्रोटीन रिसीवर में सबसे पहले प्रवेश करते हैं। हाल ही में, झरझरा कांच के मोतियों को पैठ क्रोमैटोग्राफी में आणविक चलनी के रूप में तेजी से उपयोग किया गया है।
जैव रसायन में वैद्युतकणसंचलन विधि एक विद्युत क्षेत्र (एमिनो एसिड, पेप्टाइड्स, प्रोटीन, न्यूक्लिक एसिड) में अणुओं की गति में अंतर पर आधारित है।
यात्रा की गति में अंतर इस पर निर्भर करता है:
1. अणु के q से: कुल q जितना अधिक होगा, अणुओं की गतिशीलता उतनी ही अधिक होगी। क्यू मान पीएच पर निर्भर करता है;
2. अणुओं के आकार पर: अणु जितने बड़े होते हैं, उनकी गतिशीलता उतनी ही कम होती है। यह घर्षण बलों में वृद्धि और बड़े अणुओं के इलेक्ट्रोस्टैटिक इंटरैक्शन के कारण है वातावरण;
3. अणुओं के आकार पर: एक ही आकार के अणु, लेकिन विभिन्न आकार, उदाहरण के लिए, तंतु और प्रोटीन ग्लोब्यूल्स की गति अलग-अलग होती है। यह घर्षण और इलेक्ट्रोस्टैटिक इंटरैक्शन की ताकतों में अंतर के कारण है।
वैद्युतकणसंचलन के प्रकार
ए) आइसोइलेक्ट्रिक फोकसिंग। पृथक्करण एक ऊर्ध्वाधर स्तंभ पर डिग्री में होता है। पीएच और वोल्टेज दोनों। एम्फोलाइट्स के विशेष वाहकों की सहायता से स्तंभ में ओलों की स्थापना की जाती है। पीएच 0 से 14 तक। पदार्थों का मिश्रण कॉलम में रखा जाता है, मैं विद्युत प्रवाह जोड़ता हूं। प्रत्येक घटक स्तंभ के उस हिस्से में चला जाता है जहां पीएच मान अपने आइसोइलेक्ट्रिक बिंदु से मेल खाता है और वहां रुक जाता है, यानी फोकस करता है।
लाभ: प्रोटीन का पृथक्करण, शुद्धिकरण और पहचान एक चरण में होती है। विधि का उच्च रिज़ॉल्यूशन (0.02 pI) है।
बी) आइसोटाकोफोरेसिस सहायक मीडिया पर वैद्युतकणसंचलन है। विद्युत प्रवाह को चालू करने के बाद, उच्चतम गतिशीलता वाले आयन पहले संबंधित इलेक्ट्रोड में चले जाते हैं, सबसे कम - मध्यवर्ती गतिशीलता वाले अंतिम वाले - बीच में स्थित होते हैं।
ग) डिस्क वैद्युतकणसंचलन - डिवाइस में बफर के साथ दो बर्तन होते हैं - ऊपरी और निचला, एक बहुपरत जेल युक्त ऊर्ध्वाधर ट्यूबों से जुड़ा होता है। चूंकि आयनित कण विद्युत प्रवाह की क्रिया के तहत चलते हैं। उच्च सरंध्रता जेल के शीर्ष पर है।
डी) इम्यूनोइलेक्ट्रोफोरेसिस - इम्यूनोडिफ्यूजन के साथ वैद्युतकणसंचलन के संयोजन की एक विधि (जटिल शारीरिक मिश्रण में एंटीजन का पता लगाने के लिए)। प्रतिजनों का मिश्रण और प्रतिरक्षी का मिश्रण एक दूसरे के लंबवत एक विशेष वाहक पर रखा जाता है। जब एक विद्युत प्रवाह चालू होता है, तो वे अलग-अलग पदार्थों में अलग हो जाते हैं और एक जेल वाहक पर फैल जाते हैं। संबंधित एंटीबॉडी के साथ प्रतिजन के मिलन बिंदु पर, चाप के रूप में एक विशिष्ट वर्षा प्रतिक्रिया होती है। गठित चापों की संख्या प्रतिजनों की संख्या से मेल खाती है।

श्रीमान प्रोटीन के निर्धारण के तरीके

बड़ी संख्या में प्रोटीन रासायनिक संरचनाऔर अमीनो एसिड अनुक्रम स्थापित नहीं किया गया है (1010-1012 प्रोटीन); इसलिए, मि। ऐसा करने में, विभिन्न तरीकों का उपयोग किया जाता है।
ए) अवसादन विधि - श्री का निर्धारण विशेष सेंट्रीफ्यूज में किया जाता है (पहला सेंट्रीफ्यूज स्वीडिश बायोकेमिस्ट स्वेडबर्ग द्वारा प्रस्तावित किया गया था), जिसमें केन्द्रापसारक त्वरण बनाना संभव है, जो कि त्वरण के 200 हजार या उससे अधिक गुना है। पृथ्वी का गुरुत्वाकर्षण। श्रीमान अणुओं के वी अवसादन द्वारा निर्धारित किया जाता है। जैसे ही अणु केंद्र से परिधि की ओर बढ़ते हैं, एक तेज प्रोटीन-विलायक इंटरफ़ेस बनता है। अवसादन दर को अवसादन स्थिरांक (S) के रूप में व्यक्त किया जाता है:

जहां वी प्रोटीन-विलायक सीमा (सेमी / एस) की गति की गति है;
- रोटर की कोणीय गति (रेड / एस);
- प्रोटीन समाधान (सेमी) के साथ रोटर के केंद्र से कोशिका के मध्य तक की दूरी।
अवसादन स्थिरांक S का मान, जो 110–13 है, को पारंपरिक रूप से 1 के रूप में लिया जाता है और इसे 1 स्वेडबर्ग (S) कहा जाता है। प्रोटीन के लिए एस 1-50 एस की सीमा में होता है, कभी-कभी 100 एस तक।
प्रोटीन का मिस्टर स्वेडबर्ग समीकरण द्वारा निर्धारित किया जाता है:

जहाँ R सार्वत्रिक गैस नियतांक है;
टी केल्विन में पूर्ण तापमान है;
एस अवसादन स्थिरांक है;
डी प्रसार गुणांक है;
 विलायक का घनत्व है;
V गैस का आंशिक विशिष्ट आयतन है।
हार्डवेयर शामिल होने के कारण यह विधि महंगी है।
अधिक सरल और सस्ता:
बी) सेफैडेक्स की एक पतली परत में जेल निस्पंदन।
प्रोटीन पथ की लंबाई (मिमी में) श्रीमान के साथ लघुगणक है।
एक्स - अंशांकन ग्राफ पर लक्ष्य प्रोटीन का श्रीमान।
c) पॉलीएक्रिलामाइड परत में डिस्क वैद्युतकणसंचलन - अंशांकन प्रोटीन के लघुगणक श्री और उनकी पथ लंबाई के बीच एक संबंध भी है।

प्रोटीन एकरूपता निर्धारित करने के तरीके

पृथक प्रोटीन की शुद्धता निम्न द्वारा निर्धारित की जाती है:

• अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन;
• डिस्क विधि - वैद्युतकणसंचलन;
• विभिन्न इम्यूनोकेमिकल तरीके;
• प्रोटीन विलेयता (नॉर्थ्रोप विधि) का निर्धारण प्रावस्था नियम पर आधारित होता है, जिसके अनुसार दी गई प्रायोगिक परिस्थितियों में शुद्ध पदार्थ की विलेयता केवल तापमान पर निर्भर करती है, लेकिन ठोस अवस्था में पदार्थ की सांद्रता पर निर्भर नहीं करती है।

यदि प्रोटीन सजातीय है, तो ग्राफ एक विभक्ति (ए) दिखाता है, यदि प्रोटीन (बी, सी) की अशुद्धियां हैं, तो हमें संतृप्ति वक्र के कई विभक्तियां मिलती हैं। सभी प्रोटीनों में घुलनशीलता के अपने अलग-अलग वक्र होते हैं।

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कैशेवा, अन्ना लियोनिदोवना। एक परमाणु बल माइक्रोस्कोप के चिप्स पर प्रोटीन और प्रोटीन परिसरों की मास स्पेक्ट्रोमेट्रिक पहचान: शोध प्रबंध ... जैविक विज्ञान के उम्मीदवार: ०३.०१.०४ / कैशेवा अन्ना लियोनिदोवना; [संरक्षण का स्थान: नौचन।-इस्लेड। बायोमेड संस्थान। रसायन शास्त्र उन्हें। वी.एन. ओरेखोविच रैम्स] .- मॉस्को, 2010.- 104 पी ।: बीमार। आरएसएल ओडी, 61 10-3 / 1308

परिचय

अध्याय 1. साहित्य समीक्षा 10

१.१. अत्यधिक संवेदनशील प्रोटिओमिक प्रौद्योगिकियों के क्षेत्र में वैज्ञानिक और तकनीकी आधारभूत कार्य का विश्लेषण

1.2 हेपेटाइटिस सी वायरस के लक्षण 20

1.2.1 हेपेटाइटिस सी के निदान के तरीके 22

१.२.२ हेपेटाइटिस सी के सीरोलॉजिकल प्रोटीन मार्कर २५

अध्याय 2. सामग्री और विधियाँ 28

२.१ एएफएम चिप्स २८

२.२ प्रोटीन की तैयारी और अभिकर्मक २९

२.३ एएफएम विश्लेषण ३०

२.४ मास स्पेक्ट्रोमेट्रिक विश्लेषण के लिए नमूना तैयार करना ३१

2.5 मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण 33

2.5.1 AFM चिप की सतह पर प्रोटीन का MALDI-MS विश्लेषण 33

२.५.२ एएफएम चिप की सतह पर प्रोटीन का ईएसआई-एमएस विश्लेषण ३४

अध्याय 3. परिणाम और उनकी चर्चा 35

3.1 विश्लेषण समाधान से एएफएम चिप की सतह पर "रासायनिक मछली पकड़ने" के माध्यम से पकड़े गए प्रोटीन की एमएस-पहचान

३.२ एक विश्लेषण समाधान से एएफएम चिप की सतह पर बायोस्पेसिफिक रूप से पकड़े गए प्रोटीन की एमएस पहचान

३.३ एमएस एएफएम चिप की सतह पर प्रोटीन की पहचान, रक्त सीरम के नमूनों से जैव विशिष्ट रूप से कैप्चर किया गया

निष्कर्ष 83

साहित्य

काम का परिचय

कार्य की प्रासंगिकता।

आधुनिक जैव रसायन में प्राथमिकता दिशाओं में से एक प्रोटिओमिक विश्लेषण के लिए प्रभावी विश्लेषणात्मक तरीकों का निर्माण है, जिसका मुख्य कार्य शरीर के प्रोटीन का पता लगाना और सूची बनाना, उनकी संरचना और कार्यों का अध्ययन और प्रोटीन इंटरैक्शन की पहचान करना है। इस समस्या के समाधान से रोगों के निदान और उनके उपचार के लिए नई प्रणाली का निर्माण होगा। आधुनिक प्रोटिओमिक विश्लेषण के मानक तरीके प्रोटीन की पहचान के लिए मास स्पेक्ट्रोमेट्रिक विधियों (एमएस) के साथ संयोजन में क्रोमैटोग्राफी, वैद्युतकणसंचलन का उपयोग करके बहु-घटक प्रोटीन मिश्रण को अलग करने पर आधारित हैं। प्रोटीन अणुओं की पहचान की गति और विश्वसनीयता के संदर्भ में मानक एमएस विश्लेषण के निस्संदेह लाभ के बावजूद, कम होने के कारण इसकी महत्वपूर्ण अनुप्रयोग सीमाएं हैं

10 "" 10 "एम के स्तर पर विश्लेषण की एकाग्रता संवेदनशीलता और जैविक सामग्री में प्रोटीन सामग्री की एक उच्च गतिशील रेंज। साथ ही, वायरल हेपेटाइटिस बी जैसे सामाजिक रूप से महत्वपूर्ण बीमारियों के बायोमार्कर सहित कार्यात्मक प्रोटीन की भारी मात्रा। और सी, ट्यूमर मार्कर, आदि, रक्त प्लाज्मा में 10 "एमआई कम की एकाग्रता सीमा में मौजूद होते हैं।

परख की एकाग्रता संवेदनशीलता की इस पद्धतिगत सीमा को दूर करने के तरीकों में से एक जैव-आणविक डिटेक्टरों का उपयोग करना है, जो एकल अणुओं और उनके परिसरों के पंजीकरण की अनुमति देता है और सैद्धांतिक रूप से एकाग्रता संवेदनशीलता में कोई सीमा नहीं है। बायोमोलेक्यूलर डिटेक्टरों में नैनोटेक्नोलॉजिकल उपकरणों जैसे परमाणु बल सूक्ष्मदर्शी (एएफएम), नैनोवायर डिटेक्टर, नैनोपोर्स और कई अन्य डिटेक्टरों पर आधारित डिटेक्टर शामिल हैं। एएफएम डिटेक्टरों की अनूठी संवेदनशीलता व्यक्तिगत प्रोटीन अणुओं की कल्पना करने और उनकी संख्या की गणना करने की अनुमति देती है। बायोमोलेक्यूलर डिटेक्टर के रूप में एएफएम का उपयोग करते समय, विशेष चिप्स का उपयोग करना आवश्यक है जो एक सीमित चिप सतह पर ऊष्मायन समाधान की एक बड़ी मात्रा से विश्लेषण के जैविक मैक्रोमोलेक्यूल्स को केंद्रित करने की अनुमति देता है। जांच की गई प्रोटीन वस्तुओं को भौतिक या रासायनिक सोखना के कारण और बायोस्पेसिफिक इंटरैक्शन (एएफएम-बायोस्पेसिफिक फिशिंग) दोनों के कारण चिप की सतह पर केंद्रित किया जा सकता है।

हालांकि, व्यवहार में, एएफएम-आधारित नैनोडेटेक्टर्स का उपयोग इस तथ्य से सीमित है कि, चिप की सतह पर अलग-अलग प्रोटीन अणुओं की कल्पना करने की संभावना के बावजूद, ऐसे डिटेक्टर उन्हें पहचानने में असमर्थ हैं, जो जटिल प्रोटीन के अध्ययन में विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। जैविक सामग्री सहित मिश्रण। इसलिए, एएफएम पद्धति की क्षमताओं को पूरा करने वाली एक विश्लेषण पद्धति का विकास एक जरूरी कार्य प्रतीत होता है। तिथि करने के लिए, एकमात्र प्रोटिओमिक विधि जो प्रोटीन अणुओं की स्पष्ट और मज़बूती से पहचान करना संभव बनाती है, वह है एमएस विश्लेषण। शोध प्रबंध कार्य में, एक दृष्टिकोण विकसित किया गया था जो एएफएम विधि की उच्च संवेदनशीलता और एक विश्लेषण समाधान से प्रोटीन और उनके परिसरों का पता लगाने के लिए विश्वसनीय एमएस पहचान को जोड़ती है।

अध्ययन के उद्देश्य और उद्देश्य।

इस कार्य का उद्देश्य परमाणु बल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके बायोमटेरियल में पहचाने गए प्रोटीन और प्रोटीन परिसरों की मास स्पेक्ट्रोमेट्रिक पहचान थी।

इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए, निम्नलिखित कार्यों को हल किया गया:

रासायनिक या जैव विशिष्ट मछली पकड़ने का उपयोग करके एएफएम चिप की सतह पर पकड़े गए प्रोटीन की एमएस पहचान के लिए एक योजना विकसित की गई है;

बाद में एमएस पहचान के लिए एएफएम चिप की सतह पर प्रोटीन के एंजाइमैटिक हाइड्रोलिसिस के लिए स्थितियां विकसित की गई हैं;

AFM चिप की सतह पर मॉडल प्रोटीन की MS पहचान की गई;

एक एएफएम चिप की सतह पर प्रोटीन की एमएस पहचान, एक बहु-घटक मिश्रण (सीरम) से बायोस्पेसिफिक रूप से पकड़ी गई थी।

काम की वैज्ञानिक नवीनता .

शोध प्रबंध में, एक योजना विकसित की गई थी जो एएफएम चिप की सतह पर एक समाधान या एक बहु-घटक मिश्रण से पकड़े गए प्रोटीन और प्रोटीन परिसरों की एमएस पहचान की अनुमति देती है। इसके लिए चुने गए इष्टतम स्थितियांएएफएम चिप की सतह पर सहसंयोजक और गैर-सहसंयोजक रूप से स्थिर प्रोटीन अणुओं के हाइड्रोलिसिस (तापमान, आर्द्रता, ट्रिप्सिनोलिटिक मिश्रण की संरचना, ट्रिप्सिनोलिसिस समय) सहित नमूनों की तैयारी। इस काम की ख़ासियत यह थी कि, एंजाइमैटिक हाइड्रोलिसिस के मानक प्रोटिओमिक प्रोटोकॉल की तुलना में, एमएस विश्लेषण के लिए नमूनों की तैयारी समाधान में नहीं, बल्कि एक सीमित क्षेत्र में की गई थी।

चिप सतह। विकसित योजना ने एमएस विश्लेषण को कुशलतापूर्वक करना और एएफएम चिप की सतह पर व्यक्तिगत प्रोटीन और प्रोटीन परिसरों दोनों की पहचान करना संभव बना दिया। अध्ययन किए गए प्रोटीन के प्रोटियोटाइपिक पेप्टाइड्स का एमएस विश्लेषण दो प्रकार के आयनीकरण का उपयोग करके किया गया था (मालदीतथा EST)और दो प्रकार के डिटेक्टर (उड़ान के समय और आयन ट्रैप)। रक्त सीरम के नमूनों में हेपेटाइटिस सी वायरस (एचसीवी) (एचसीवीकोरएजी और ई2) के प्रोटीन मार्करों का पता लगाने के लिए एएफएम-बायोस्पेसिफिक फिशिंग और एमएस के संयोजन के लिए विकसित योजना का भी सफलतापूर्वक परीक्षण किया गया था।

काम का व्यावहारिक महत्व .

इस काम के परिणाम रक्त सीरम सहित कम सांद्रता में एक जैविक सामग्री में प्रोटीन का पता लगाने के लिए नमूने तैयार करने के लिए लेबल और अतिरिक्त प्रक्रियाओं के उपयोग के बिना अत्यधिक संवेदनशील प्रोटिओमिक विधियों को बनाना संभव बनाते हैं। परमाणु बल माइक्रोस्कोपी और मास स्पेक्ट्रोमेट्री पर आधारित एक दृष्टिकोण प्रस्तावित किया गया है, जिससे मानव सीरम में हेपेटाइटिस सी वायरस के प्रोटीन मार्करों का पता लगाना और उनकी पहचान करना संभव हो जाएगा।

सामाजिक रूप से महत्वपूर्ण बीमारियों की एक विस्तृत श्रृंखला के बायोमार्कर की खोज करते हुए, नए नैदानिक ​​​​चिप्स बनाने के उद्देश्य से विकास में दृष्टिकोण का उपयोग किया जा सकता है।

कार्य की स्वीकृति।

शोध के मुख्य परिणाम "नैनो टेक्नोलॉजी पर पहले, दूसरे और तीसरे अंतर्राष्ट्रीय फोरम" (मास्को, 2008-2010) में प्रस्तुत किए गए थे; "रूसी सोसायटी ऑफ बायोकेमिस्ट्स एंड मॉलिक्यूलर बायोलॉजिस्ट की IV कांग्रेस", नोवोसिबिर्स्क, 2008; अंतर्राष्ट्रीय कांग्रेस "ह्यूमन प्रोटिओम", एम्स्टर्डम, 2008 में; इंटरनेशनल कांग्रेस "ह्यूमन प्रोटिओम", सिडनी, 2010 में।

प्रकाशन।

थीसिस की संरचना और दायरा।

शोध प्रबंध में एक परिचय, एक साहित्य समीक्षा, सामग्री और शोध विधियों का विवरण, शोध परिणाम और उनकी चर्चा, निष्कर्ष, निष्कर्ष और संदर्भों की एक सूची शामिल है। काम १०४ पृष्ठों पर प्रस्तुत किया गया है, ३३ ​​आंकड़ों और ४ तालिकाओं के साथ चित्रित किया गया है, संदर्भों की सूची में १५९ शीर्षक हैं।

अत्यधिक संवेदनशील प्रोटिओमिक प्रौद्योगिकियों के क्षेत्र में वैज्ञानिक और तकनीकी आधारभूत कार्य का विश्लेषण

आधुनिक विज्ञान में प्राथमिकता दिशाओं में से एक है शरीर में विभिन्न प्रकार के प्रोटीन की भूमिका की खोज और स्पष्टीकरण, साथ ही आणविक तंत्र को समझना जिससे रोगों के विकास में वृद्धि हुई है।

प्रोटिओमिक विधियों के निरंतर सुधार के बावजूद, पिछले एक दशक में नए खोजे गए रोग बायोमार्कर की संख्या व्यावहारिक रूप से / अपरिवर्तित बनी हुई है। यह इस तथ्य के कारण है कि पारंपरिक प्रोटिओमिक विधियों का पता लगाने की एकाग्रता सीमा जैविक सामग्री में बायोमार्कर सहित 10``9 एम और उससे कम) से अधिक नहीं है। चूंकि यह माना जा सकता है कि यह इन सांद्रता श्रेणियों में है कि अधिकांश रोगों के प्रोटीन मार्कर स्थित हैं।

सक्रिय रूप से विकासशील दिशाओं में से एक, जो विश्लेषण की एकाग्रता संवेदनशीलता को कुछ हद तक बढ़ाना संभव बनाता है, बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमीटर के साथ संगत नैनोक्रोमैटोग्राफिक और नैनोइलेक्ट्रोफोरेटिक सिस्टम पर आधारित विश्लेषणात्मक परिसरों का निर्माण है।

मास स्पेक्ट्रोमेट्री और इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण के संयोजन में नैनोक्रोमैटोग्राफिक प्रणाली ने उच्च-रिज़ॉल्यूशन क्रोमैटोग्राफी (एचपीएलसी) की तुलना में परिमाण के दो आदेशों द्वारा प्रोटीन की पहचान संवेदनशीलता को बढ़ाना संभव बना दिया। ऐसी युग्मित प्रणालियों की एकाग्रता संवेदनशीलता की सीमा वैद्युतकणसंचलन / क्रोमैटोग्राफी चरण की संवेदनशीलता से सीमित होती है, और व्यक्तिगत प्रोटीन के लिए 10-12 एम से अधिक नहीं होती है (उदाहरण के लिए, साइटोक्रोम सी और ब्रैडीकाइनिन के लिए)।

वर्तमान में, क्रोमैटोग्राफिक विधियां अलग-अलग स्वतंत्र दिशाओं में विकसित हुई हैं - SELDI MS विश्लेषण (सतह वर्धित लेजर desorption और आयनीकरण / उड़ान मास स्पेक्ट्रोमेट्री का समय), चुंबकीय माइक्रोपार्टिकल्स का उपयोग करके प्रोटीन मछली पकड़ने के तरीके। इन तकनीकों में, SELDI चिप्स की हाइड्रोफोबिक या आवेशित सतहें हैं। या मास स्पेक्ट्रोमेट्रिक विश्लेषण के संयोजन में चुंबकीय माइक्रोपार्टिकल्स का सफलतापूर्वक उपयोग किया जाता है: के लिए? अलग-अलग प्रकारों के रूप में पहचान और पहचान; प्रोटीन, और रक्त सीरम के प्रोटीन/पेप्टाइड प्रोफाइलिंग के लिए [सी, 8; \ बी, 15]। SEbDIi है: एक शक्तिशाली दृष्टिकोण जो रासायनिक रूप से सक्रिय होने पर बायोमोलेक्यूल्स (प्रोटीनजे। पेप्टाइड्स) के सोखना के माध्यम से एक बायोमटेरियल का अध्ययन करना संभव बनाता है? सतह (केशन/आयन एक्सचेंज चिप्स) के बाद adsorbed का मास स्पेक्ट्रोमेट्रिक विश्लेषण: अणु:। SEEDPМЄ दृष्टिकोण लागू किया जाता है; प्रोटीन-बायोमैटेरियल प्रोफाइलिंग के लिए; और हाल ही में: "प्रोटिओमिक बारकोड द्वारा निदान" के रूप में इस्तेमाल किया जाने लगा [17] .. ऐसे "बारकोड डायग्नोस्टिक्स" का सार पहचानना है? जैविक नमूने के प्रोटीन प्रोफाइल की विशेषताएं; एक विशिष्ट बीमारी से जुड़े: तो, यह ज्ञात है; किस लिए आर. कैंसर, बायोमटेरियल का "प्रोटिओमिक बारकोड" स्वस्थ1 समूहों "व्यक्तियों के" से काफी अलग है: इसलिए, प्रोटीन में परिवर्तन पर नियंत्रण; जैव सामग्री की संरचना रोगों के शीघ्र निदान का आधार बन सकती है। पर; आज, एक SELDI दृष्टिकोण का उपयोग कर रहे हैं? MЄ मार्करों की पहचान की गई है। पेट, डिम्बग्रंथि, प्रोस्टेट और स्तन कैंसर: इस पद्धति की सीमा उच्च संकल्प और विश्वसनीयता वाले प्रोटीन की पहचान करने में असमर्थता है, जो विशेष रूप से महत्वपूर्ण है जब; जैविक सामग्री जैसे बहुघटक मिश्रणों का विश्लेषण।

मौजूदा विश्लेषणात्मक प्रणालियों की कम सांद्रता संवेदनशीलता की समस्या के अलावा, जैविक सामग्री के प्रोटिओमिक विश्लेषण के लिए एक बड़ी बाधा प्रोटीन सांद्रता की एक विस्तृत गतिशील श्रेणी बन गई है, विशेष रूप से रक्त सीरम में, जो 1 (जीएम से व्यक्तिगत प्रोटीन अणुओं में भिन्न होता है। हाई-कॉपी (प्रमुख) प्रोटीन ऐसे सिस्टम में लो-कॉपी (माइनर) प्रोटीन की पहचान और पहचान को रोकते हैं।

एक बायोमटेरियल में प्रोटीन की एक विस्तृत सांद्रता रेंज की समस्या को प्रमुख प्रोटीन अंशों से रक्त सीरम की कमी के तरीकों को लागू करके हल किया जा सकता है, जटिल मिश्रण से प्रोटीन विश्लेषण अणुओं के जैव विशिष्ट और रासायनिक मछली पकड़ने के आधार पर बहु-घटक मिश्रण और नैनो-तकनीकी तरीकों को अलग करने के तरीके। चिप्स की सतह पर विभिन्न बायोसेंसर या एक सक्रिय सतह पर चुंबकीय माइक्रोस्फीयर।

परंपरागत रूप से, बहु-घटक प्रोटीन मिश्रण को अलग करने के लिए एक-आयामी, अधिक बार द्वि-आयामी, जेल वैद्युतकणसंचलन का उपयोग किया जाता है। दो-आयामी जेल वैद्युतकणसंचलन विधियों द्वारा प्रोटीन पृथक्करण का सिद्धांत उनके आइसोइलेक्ट्रिक बिंदुओं के मूल्यों के अनुसार प्रोटीन के बीच अंतर पर आधारित है। प्रोटिओमिक्स में, इन दृष्टिकोणों का उपयोग बायोमटेरियल (ऊतक, रक्त प्लाज्मा, आदि) के प्रोटीन मानचित्रण के लिए किया जाता है। मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ 1डी और/या 2डी वैद्युतकणसंचलन का संयोजन अलग और दृश्य प्रोटीन की पहचान के लिए अनुमति देता है। हालांकि, द्वि-आयामी जेल वैद्युतकणसंचलन की प्रक्रिया अभी भी स्वचालित नहीं है, यह प्रदर्शन करने के लिए काफी जटिल और समय लेने वाली है, इसके लिए ऑपरेटर की उच्च योग्यता की आवश्यकता होती है, और विश्लेषण के परिणाम अक्सर खराब प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य होते हैं।

द्वि-आयामी वैद्युतकणसंचलन की तुलना में प्रोटीन को अलग करने के लिए एक अधिक सुविधाजनक प्रक्रिया उच्च-रिज़ॉल्यूशन क्रोमैटोग्राफी (एचपीएलसी) है; जो एक स्वचालित प्रक्रिया है जो आपको बाद में कम-प्रतिलिपि प्रोटीन की पहचान करने के लिए एक जटिल मिश्रण से उच्च-प्रतिलिपि प्रोटीन को निकालने की अनुमति देती है।

जटिल मिश्रणों में प्रोटीन की प्रत्यक्ष पहचान के लिए, एक क्रोमैटोग्राफिक कॉलम को मास स्पेक्ट्रोमीटर से जोड़ा जा सकता है। हालांकि, अक्षुण्ण प्रोटीन व्यावहारिक रूप से एचपीएलसी का उपयोग करके उच्च-गुणवत्ता वाले पृथक्करण के लिए उत्तरदायी नहीं हैं, क्योंकि वे विश्लेषण के दौरान विकृत हो जाते हैं (मध्यम के कम पीएच मान और कार्बनिक सॉल्वैंट्स की उच्च सांद्रता के कारण), और द्रव्यमान की कम सटीकता के कारण भी। स्पेक्ट्रोमेट्रिक विश्लेषण, इसलिए, अधिकांश अक्षुण्ण प्रोटीन की प्रत्यक्ष पहचान, विशेष रूप से 10 kDa से अधिक आणविक भार के साथ, अक्सर संभव नहीं होता है। विश्लेषणात्मक माप सटीकता में प्रोटीन के हाइड्रोलाइटिक दरार से पेप्टाइड टुकड़ों में सुधार किया जा सकता है, प्रोटीज का उपयोग करके आणविक भार 700 से 4000 दा तक; जैसे ट्रिप्सिन (बॉटम-अप टेक्नोलॉजी)। एक मिश्रण में प्रोटीन के उच्च-गुणवत्ता वाले पृथक्करण को प्राप्त करने के लिए, कई क्रोमैटोग्राफिक प्रक्रियाओं के संयोजन का उपयोग किया जाता है, तथाकथित बहुआयामी क्रोमैटोग्राफी।

हेपेटाइटिस के निदान के तरीके

वर्तमान में, हेपेटाइटिस सी के प्रोटीन निदान के लिए एंटी-एचसीवीकोर परीक्षण प्रणाली का उपयोग किया जाता है। एंटी-एचसीवीकोर एंटीबॉडी की उपस्थिति का पता लगाने के लिए पहला एलिसा परीक्षण 1990 के दशक की शुरुआत में उपलब्ध हो गया था, लेकिन उनमें संवेदनशीलता और चयनात्मकता कम थी। बाद में, 90 के दशक के अंत में, एक नई पीढ़ी के एंटी-एचसीवीकोर के लिए एलिसा परीक्षण सामने आए, जिसमें लगभग 95-99% की उच्च संवेदनशीलता थी और संक्रमण के कई महीनों बाद एचसीवी का पता लगा सकता था।

उदाहरण के लिए, 1996 में, वेक्टर-बेस्ट (नोवोसिबिर्स्क) और डायग्नोस्टिक सिस्टम्स (निज़नी नोवगोरोड) द्वारा विकसित परीक्षण सिस्टम एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए रूसी बाजार में दिखाई दिए - एंटी-एचसीवी आईजीएम वर्ग। सेरोडायग्नोसिस में आईजीएम एंटीबॉडी की भूमिका का पर्याप्त अध्ययन नहीं किया गया है, हालांकि, कुछ अध्ययनों ने क्रोनिक हेपेटाइटिस सी का पता लगाने के लिए इस मार्कर के मूल्य को दिखाया है। यह भी पाया गया कि रोगियों में आरएनए वायरस और एंटी-एचसीवी आईजीएम का पता लगाने के बीच संबंध 80-95% है। वायरल हेपेटाइटिस सी के विकास के चरण का निर्धारण करने के लिए अफानसेव ए.यू। एट अल रोगियों के रक्त में एंटी-एचसीवी आईजीजी और एंटी-एचसीवी आईजीएम के अनुपात को दर्शाने वाले गुणांक का उपयोग किया। आज तक, कई एंजाइम-लिंक्ड इम्युनोसॉरबेंट परख (एलिसा) सिस्टम विकसित किए गए हैं जो हेपेटाइटिस बी वायरस के कई एपिटोप्स में परिसंचारी एंटीबॉडी का पता लगाते हैं।

आधुनिक प्रयोगशाला निदान: वायरल हेपेटाइटिस मास्को में अधिकांश चिकित्सा संस्थानों में किया जाता है; रूसी संघ के स्वास्थ्य मंत्रालय और स्वास्थ्य विभाग के मौजूदा आदेशों के अनुसार: मास्को और इम्युनोग्लोबुलिन का निर्धारण है? रोगियों के रक्त सीरम में वर्ग जी से हेपेटाइटिस Є वायरस (एंटी-एचजीवी आईजीजी)। इस मार्कर की पहचान किसी को वर्तमान या पिछले संक्रमण की उपस्थिति का न्याय करने की अनुमति देती है।

विधियों के नुकसान; ईईआईएसए पर आधारित डिटेक्शन, कम संवेदनशीलता के अलावा (GO "12 M से अधिक) j भी झूठी पहचान के कारण होते हैं; रोगियों में वायरल हेपेटाइटिस, पोस्ट-संक्रामक प्रतिरक्षा के कारण, एंटीबॉडी की क्रॉस-रिएक्टिविटी, साथ ही अपर्याप्त तीव्र अवधि के दौरान संवेदनशीलता) चरण बीएफजी बीआई कनेक्शन? एस: यह सक्रिय रूप से "हेपेटाइटिस" के 1 मार्करों का पता लगाने के संवेदनशील, विशिष्ट, तेज और आसानी से लागू होने वाले तरीकों की खोज जारी रखता है।

एक और समूहपता लगाने के तरीके, सीरम में वायरल हेपेटाइटिस: रक्त में शामिल हैं-ВІ पंजीकरण, पीसीआर का उपयोग कर आरएनए बीईएस; आरएनए का निर्धारण। बीएफजी तरीके; एचएसआर को प्राथमिक परीक्षण के रूप में उपयोग नहीं किया जा सकता है - पुष्टि या बहिष्करण; निदान; लेकिन; शायद; निदान की पुष्टि के लिए उपयोगी: बीएफजी का निदान1 आरएनए के 5-अनकोडेड क्षेत्र का विश्लेषण करके किया जाता है। हालांकि, विभिन्न बीएफजी जीनोटाइप के बीच परख परिणाम भिन्न होते हैं।

रूसी बाजार में जैविक माइक्रोचिप्स दिखाई दिए हैं, जिससे - बीएफजी जीनोटाइपिंग और - एक प्रभावी एंटीवायरल योजना निर्धारित करने की अनुमति मिलती है; चिकित्सा। यह बायोचिप NS5B क्षेत्र के विश्लेषण के आधार पर BFG जीनोटाइपिंग के लिए एक ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड चिप है। प्राप्त परिणाम बायोचिप की सभी 6 जीनोटाइप और एचसीवी के 36 उपप्रकारों की पहचान करने की क्षमता को इंगित करते हैं, जिसमें सबसे अधिक विषाणु और दवा प्रतिरोधी रूप शामिल हैं।

एक ओर, पीसीआर विश्लेषण विधियां हाइपरसेंसिटिव हैं और नमूने में सिर्फ एक आरएनए अणु से संकेत का पता लगाने और बढ़ाने की अनुमति देती हैं, लेकिन दूसरी ओर, इन विधियों को नमूनों के आकस्मिक संदूषण, झूठे नकारात्मक परिणामों के कारण झूठे सकारात्मक परिणामों की विशेषता है। वायरस की उच्च परिवर्तनशीलता और अपेक्षाकृत उच्च विश्लेषण लागत के कारण। एक ही व्यक्ति में भी, एचसीवी आरएनए का स्तर समय-समय पर मिलियोट्रेस से अधिक बदल सकता है, जिससे कम होने की स्थिति में झूठे नकारात्मक परिणाम सामने आते हैं? वायरस की प्रतिकृति या यदि वायरस रक्तप्रवाह में प्रवेश किए बिना ऊतकों में बना रहता है। विभिन्न प्रयोगशालाओं में RІZH, HCV के मात्रात्मक निर्धारण के परिणाम पर्याप्त रूप से सहमत नहीं हैं।

एचसीवी के प्रोटीन प्रतिजन बीटी बायोमैटिरियल्स में वायरल हेपेटाइटिस सी का शीघ्र पता लगाने के लिए विशेष महत्व रखते हैं क्योंकि वे जीव के पूर्ण प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के विकास से पहले भी कई सप्ताह पहले रक्त सीरम में दिखाई देते हैं।

हेपेटाइटिस सी वायरस का सरफेस एंटीजन एचसीवीकोरएजी संक्रमण का मुख्य मार्कर है - वायरस, हेपेटाइटिस सी। यह शरीर की प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के कारण और नैदानिक ​​लक्षणों के विकास से पहले रक्त में एंटीबॉडी की उपस्थिति से 16 सप्ताह पहले पता चला है, जबकि यह तीव्र और जीर्ण दोनों चरणों के रोगों में दर्ज है। एचसीवीकोरएजी की पहचान के आधार पर तीव्र चरण में हेपेटाइटिस सी के एलिसा निदान के लिए केवल एक विदेशी वाणिज्यिक उत्पाद (ऑर्थो क्लिनिकल डायग्नोस्टिक्स) है।

121 अमीनो एसिड अवशेषों से युक्त संरचनात्मक प्रोटीन HCVcoreAg, पॉलीपेप्टाइड के एन-टर्मिनस पर स्थित है और सेलुलर प्रोटीज के प्रभाव में बनता है। पहला प्रोटियोलिटिक हाइड्रोलिसिस अवशेष 191 और 192 (C1 साइट) के बीच होता है और E1 ग्लाइकोप्रोटीन के निर्माण की ओर जाता है। दूसरा दरार स्थल (C2) 174 और 191 अमीनो एसिड के बीच है। संबंधित दरार उत्पादों को p21 और p23 नाम दिया गया है। कई स्तनधारी कोशिकाओं में अभिव्यक्ति के विश्लेषण से पता चला है कि p21 मुख्य उत्पाद है, जबकि p23 मामूली मात्रा में पाया जाता है। यह संभव है कि C1 और C2 साइटों पर दरार परस्पर संबंधित प्रक्रियाएं हों, क्योंकि p21 उन परिस्थितियों में बनता है जब G2 पर कोई हाइड्रोलिसिस नहीं देखा जाता है [G45]। HCVcoreAg एक प्रमुख आरएनए-बाध्यकारी प्रोटीन है जो वायरल न्यूक्लियोकैप्सिड बनाता प्रतीत होता है। इस प्रोटीन के जैव रासायनिक गुण अभी भी खराब हैं। "हेपेटाइटिस सी वायरस कणों" के एएफएम अध्ययन ने एचसीवी कैप्सिड की एक छवि प्राप्त करना संभव बना दिया।

एएफएम चिप्स

कार्य के प्रायोगिक भाग में दो प्रकार के AFM चिप्स का प्रयोग किया गया। एएफएम चिप्स की सतह पर मॉडल प्रोटीन की पहचान करने के लिए पहले प्रकार का उपयोग किया गया था। ये चिप्स कार्यात्मक रूप से सक्रिय रासायनिक समूहों के साथ सब्सट्रेट थे (बाद में रासायनिक रूप से सक्रिय सतह के साथ एएफएम चिप्स के रूप में संदर्भित), जिस पर अध्ययन किए गए अणुओं को सहसंयोजक बंधनों, तथाकथित "रासायनिक मछली पकड़ने" प्रक्रिया के कारण पकड़ा गया और अपरिवर्तनीय रूप से स्थिर कर दिया गया। दूसरे प्रकार के एएफएम चिप्स का उपयोग एमएस की पहचान के लिए प्रोटीन की उनकी सतह पर किया गया था, जो कि एक विश्लेषण समाधान से बायोस्पेसिफिक रूप से पकड़ा गया था। काम करने वाले क्षेत्रों में, इन चिप्स की सतह पर जैविक जांच को पहले से स्थिर किया गया था। वायरल हेपेटाइटिस बी और सी (बीएफबी और बीएफसी) के मार्कर प्रोटीन के खिलाफ मोनोक्लोनल एंटीबॉडी या जीपीएल 20 प्रोटीन और थ्रोम्बिन के खिलाफ एप्टैमर को जैविक जांच के रूप में इस्तेमाल किया गया था। बायोस्पेसिफिक फिशिंग प्रक्रिया के लिए, सहसंयोजी रूप से स्थिर जांच अणुओं वाले चिप्स को इनक्यूबेट किया गया था। % विश्लेषण समाधान में केवल पता लगाने योग्य प्रोटीन, या रक्त सीरम के नमूने शामिल हैं

पहले प्रकार के एएफएम चिप्स की सतह पर सहसंयोजक रूप से स्थिर मॉडल प्रोटीन की एमएस पहचान का कार्य करने के लिए, हमने इस्तेमाल किया: एविडिन (एगिलेंट, यूएसए), एचएसए (एगिलेंट, यूएसए), पी 450 वीएमजेड (कृपया प्रोफेसर ए.वी. मुनरो द्वारा प्रदान किया गया, मैनचेस्टर विश्वविद्यालय, यूके), थ्रोम्बिन (सिग्मा, यूएसए), ए-एफपी और एंटी-ए-एफपी (यूएसबीओ, यूएसए); दूसरे प्रकार के एएफएम चिप्स की सतह पर प्रोटीन की एमएस पहचान के कार्य को करने के लिए, विश्लेषण समाधान से बायोस्पेसिफिक रूप से पकड़ा गया, मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (एमसीए) को जांच अणुओं के रूप में इस्तेमाल किया गया: एंटी-एचसीवीकोर (वायरोजेन, यूएसए), एंटी-एचबीवीकोर (रिसर्च इंस्टीट्यूट ऑफ मॉलिक्यूलर डायग्नोस्टिक्स, मॉस्को), एंटी-HBsAg (Aldevron, USA), लक्ष्य अणुओं के रूप में: HBVcoreAg, HCVcoreAg (Virogen, USA) और HBsAg (Aldevron, USA), gpl20 (सिग्मा, यूएसए), ट्रोपोनिन (USBio, अमेरीका)।

इसके अलावा, काम में निम्नलिखित पदार्थों का उपयोग किया गया था: एसीटोनिट्राइल, आइसोप्रोपेनॉल, फॉर्मिक एसिड, डिस्टिल्ड वॉटर (मर्क, यूएसए), ट्राइफ्लोरोएसेटिक एसिड (टीएफए), अमोनियम बाइकार्बोनेट (सिग्मा, यूएसए), ए-सायनो-4-हाइड्रॉक्सीसेनामिक एसिड ( एचसीसीए), डायहाइड्रोक्सीबेन्जोइक एसिड - (डीएचबी) (ब्रूकर डाल्टनिक्स, जर्मनी), ट्रिप्सिन (पेमरेगा, यूएसए)।

एएफएम अध्ययनों के लिए रक्त सीरम के नमूने रूसी राज्य चिकित्सा विश्वविद्यालय के बच्चों में संक्रामक रोगों के विभाग, रोस्पोट्रेबनादज़ोर के केंद्रीय अनुसंधान संस्थान और गैब्रिचेवस्की एमएनआईआईईएम द्वारा प्रदान किए गए थे: रक्त सीरम में हेपेटाइटिस सी वायरस (एचसीवी) कणों की उपस्थिति पोलीमरेज़ (चेन रिएक्शन (पीसीआर) विधि) परीक्षण प्रणाली "एम्पलिसेंस एचसीवी मॉनिटर" (सेंट्रल रिसर्च इंस्टीट्यूट ऑफ एपिडेमियोलॉजी, रूसी संघ के स्वास्थ्य मंत्रालय, मॉस्को) का उपयोग करके नमूनों की पुष्टि की गई थी।

एएफएम विश्लेषण जैव चिकित्सा रसायन संस्थान, रूसी चिकित्सा विज्ञान अकादमी में नैनोबायोटेक्नोलॉजी की प्रयोगशाला में किया गया था। एएफएम चिप की सतह पर प्रोटीन और एंटीजन/एंटीबॉडी परिसरों की गिनती की गई आधारितकला में वर्णित विधि के अनुसार, एएफएम के साथ मापा प्रोटीन और उनके परिसरों की संबंधित छवियों की ऊंचाइयों को सहसंबंधित करना। "एसीएम एनटीईजीआरए" (एनटी-एमडीटी, रूस) का इस्तेमाल किया गया था। AFM माप अर्ध-संपर्क मोड में किए गए थे। NT-MDT NSG10 कैंटिलीवर को जांच के रूप में इस्तेमाल किया गया था। सुइयों की वक्रता की विशिष्ट त्रिज्या 10 एनएम थी, प्रतिध्वनि आवृत्ति 190 से 325 kHz की सीमा में थी। चिप का स्कैनिंग क्षेत्र 400 माइक्रोन 2 था। प्रत्येक माप कम से कम 3 बार किया गया था।

AFM चिप की सतह पर प्रोटीन और aptamers का स्थिरीकरण निम्नलिखित प्रक्रिया के अनुसार किया गया था।

2 μl की मात्रा के साथ एक प्रोटीन समाधान (0.1 cM) में NHS / EDC मिश्रण (v / v = l / l) के घोल के 8 μl को जोड़ा गया और अच्छी तरह मिलाया गया। परिणामी मिश्रण को सिलानाइज्ड-चिप की सतह पर लगाया गया और कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए इनक्यूबेट किया गया। फिर चिप को दो बार थर्मल शेकर में ८०० आरपीएम और ३७ डिग्री सेल्सियस पर १ मिलीलीटर विआयनीकृत पानी से धोया गया। AFM चिप की सतह पर प्रोटीन के स्थिरीकरण की गुणवत्ता की निगरानी परमाणु बल माइक्रोस्कोपी द्वारा की गई थी।

ए-एम चिप की रासायनिक रूप से सक्रिय सतह पर एप्टामर्स का स्थिरीकरण निम्नानुसार किया गया था। डीएमएसओ / इथेनॉल (वी / वी = एल / एल) में 1.2 मिमी की एकाग्रता के साथ डीएसपी के स्टॉक समाधान में पीबीएस बफर 50 मिमी (पीएच 7.4,) का एक समाधान जोड़ा गया था, वह भी 1/1 के अनुपात में आयतन। परिणामी कार्य समाधान एएफएम चिप की सतह पर लागू किया गया था और 10 मिनट के लिए ऊष्मायन किया गया था। उसके बाद, 1 मिलीलीटर पानी में इथेनॉल के 50% घोल से 15C पर 10 मिनट के लिए धुलाई की गई। 3 JIM की सांद्रता के साथ aptamer का एक समाधान AFM चिप के सक्रिय क्षेत्र में लागू किया गया था और 800 आरपीएम पर सरगर्मी के साथ 4 मिनट के लिए ऊष्मायन किया गया था। डीएसपी क्रॉस-लिंकर के गैर-प्रतिक्रिया वाले अमीनो समूहों को 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 5 मिमी ट्रिस-एचसीएल समाधान की उपस्थिति में अवरुद्ध किया गया था। धोने का अंतिम चरण 10 मिनट के लिए 1 मिलीलीटर के जलीय घोल के साथ दो बार किया गया था। 25सी.

एक ट्रिप्सिनोलिटिक मिश्रण जिसमें १५० मिमी NH4HCO3, एसीटोनिट्राइल, ०.५ एम गुआनिडीन हाइड्रोक्लोराइड, और ग्लिसरॉल (पीएच ७.४) का बफर समाधान होता है, को स्थिर जांच अणुओं के साथ एएफएम चिप की सतह पर लागू किया गया था। फिर, 0.1 μM की एकाग्रता के साथ पोर्सिन संशोधित ट्रिप्सिन के समाधान के 0.5 μl को बफर समाधान में जोड़ा गया था। AFM चिप को 45C के निरंतर तापमान पर 2 घंटे के लिए आर्द्र वातावरण में ऊष्मायन किया गया था, 0.5 μl ट्रिप्सिन समाधान (0.1 μM) को फिर से इसकी सतह पर जोड़ा गया था, और ऊष्मायन 12 घंटे तक जारी रहा। ट्रिप्सिनोलिटिक मिश्रण को एएफएम चिप की सतह से 10 μL रेफरेंस सॉल्यूशन से धोया गया था जिसमें 0.7% ट्राइफ्लोरोएसेटिक एसिड (टीएफए) में 70% एसीटोनिट्राइल था। इस प्रकार AFM चिप की सतह से प्राप्त हाइड्रोलाइज़ेट को ४५C और ४२०० आरपीएम पर एक वैक्यूम बाष्पीकरण में सुखाया गया था। इसके बाद, पेप्टाइड मिश्रण को 5% फॉर्मिक एसिड समाधान के 10 μl में या बाद के एमएस विश्लेषण के लिए 0.7% TFA समाधान के 10 μl में भंग कर दिया गया था।

MALDI- प्रकार के आयनीकरण के साथ MS विश्लेषण करते समय, नमूनों की तैयारी निम्नानुसार की गई। 10 μL TFA के 0.7% घोल में घुले नमूनों को निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार ZipTip C18 माइक्रोटिप्स (मिलिपोर, यूएसए) का उपयोग करके केंद्रित और अलवणीकृत किया गया और 0 के साथ एसीटोनिट्राइल के 50% समाधान में एचसीसीए या डीएचबी युक्त संतृप्त मैट्रिक्स समाधान के साथ मिलाया गया। , 7% टीएफए। परिणामी मिश्रण को MTP आकार के MALDI लक्ष्य पर लागू किया गया था।

-विश्लेषण समाधान से एएफएम चिप की सतह पर "रासायनिक मछली पकड़ने" के माध्यम से पकड़े गए प्रोटीन की पहचान

प्रायोगिक कार्य के इस चरण में, विश्लेषण समाधान से AFM चिप्स की सतह पर रासायनिक रूप से स्थिर मॉडल प्रोटीन के लिए MS स्पेक्ट्रा प्राप्त किया गया था। एविडिन, एचएसए, एंटी-एएफपी के लिए विश्लेषण समाधान में अध्ययन किए गए प्रोटीन की एकाग्रता सीमा 10 "-10" 9 एम, ट्रोपोनिन, एएफपी और पी 450 वीएमजेड - 10 "6-10" 8 एम थी।

एमएस विश्लेषण 6 प्रकार के प्रोटीनों के लिए किया गया था, मूल में भिन्न, आणविक भार, ट्रिप्सिनोलिसिस साइटों की संख्या और उनकी स्थानिक पहुंच, अमीनो एसिड अनुक्रम की हाइड्रोफोबिसिटी की डिग्री (हाइड्रोफोबिक से हाइड्रोफिलिक अमीनो एसिड का अनुपात), जो सहसंयोजक स्थिर थे एक विश्लेषण समाधान (तालिका 1) से एएफएम चिप की सतह पर। इन प्रयोगों में, एएफएम चिप्स का उपयोग किया गया था, जिसमें कार्य और नियंत्रण क्षेत्र शामिल थे। कार्य क्षेत्र एएफएम चिप सतह का रासायनिक रूप से "सक्रिय" क्षेत्र था, जिस पर मॉडल प्रोटीन की "रासायनिक मछली पकड़ने" हुई; नियंत्रण क्षेत्र चिप की सतह का रासायनिक रूप से निष्क्रिय क्षेत्र था। देखे गए कैप्चर किए गए अणुओं की गिनती AFM का उपयोग करके दर्ज की गई थी। उपरोक्त मॉडल प्रोटीन के लिए प्राप्त एएफएम विश्लेषण के प्रयोगात्मक डेटा, अर्थात् एएफएम चिप के कार्य क्षेत्र की सतह पर पकड़े गए अणुओं की संख्या तालिका 2 में प्रस्तुत की गई है। कॉलम "समाधान में प्रोटीन अणुओं की एकाग्रता" तालिका 2 विश्लेषण समाधान में संबंधित प्रोटीन की न्यूनतम दर्ज की गई एकाग्रता के लिए डेटा दिखाती है।

जैसा कि टेबल्स 2 से देखा जा सकता है, सभी प्रस्तुत प्रोटीनों के लिए एएफएम चिप के कार्य क्षेत्र में पंजीकृत अणुओं की संख्या -1040 अणु थी। एमएस डिटेक्टरों की संवेदनशीलता सीमा लगभग 105 अणु है। इस प्रकार, प्रस्तुत मॉडल प्रोटीन के लिए, एएफएम चिप की सतह पर सफल अपरिवर्तनीय स्थिरीकरण किया गया था, और बाद में एमएस पहचान के लिए एएफएम का पता चला प्रोटीन वस्तुओं की संख्या पर्याप्त थी। साथ ही, ऊष्मायन समाधान में मॉडल प्रोटीन की न्यूनतम दर्ज की गई एकाग्रता काफी कम 10 "-10" एम थी।

MALDI और ESI प्रकार के आयनीकरण का उपयोग करके नमूनों का मास स्पेक्ट्रोमेट्रिक विश्लेषण किया गया। 10'9 एम की एकाग्रता के साथ एविडिन के एक उपयुक्त समाधान में ऊष्मायन के बाद एएफएम चिप। इन स्पेक्ट्रा के विश्लेषण ने एविडिन (गैलस गैलस) को इसके दो प्रोटियोटाइपिक पेप्टाइड्स द्वारा विश्वसनीय रूप से पहचानना संभव बना दिया: एसएसवीएनडीआईजीडीडीडब्ल्यूके (एम / जेड = 618.6) और वीजीआईएनएफटीआर (एम / जेड = ४६०.४)। दोनों पेप्टाइड्स में उनके दोगुने चार्ज आयनों (एमएस स्पेक्ट्रा) की अच्छी तरह से परिभाषित चोटियां थीं। एएफएम-एमएस विश्लेषण के साथ विश्लेषण प्रोटीन के समाधान में ऊष्मायन के बाद एएफएम चिप के रासायनिक रूप से सक्रिय कार्य क्षेत्र का विश्लेषण। 10-8 M की सांद्रता से एक और छोटा प्रोटीन प्रकट हुआ - ट्रोपोनिन I। पेप्टाइड दोगुना चार्ज आयन 1449 Da के अनुरूप MS और MS / MS स्पेक्ट्रा को चित्र 3 में दिखाया गया है। प्रयोगात्मक रूप से प्राप्त स्पेक्ट्रा के MS विश्लेषण ने मज़बूती से प्रकट करना संभव बना दिया और एएफएम चिप की सतह पर 95% से अधिक की संभावना के साथ मानव ट्रोपोनिन (जीआई 2460249) की पहचान करें ...

चित्र 5 एक गोलाकार प्रोटीन, मानव सीरम एल्ब्यूमिन (HSA) के अग्रानुक्रम विखंडन स्पेक्ट्रा को दर्शाता है, जो रक्त प्लाज्मा में परिवहन कार्य करता है। स्पेक्ट्रा को एएफएम चिप के रासायनिक रूप से सक्रिय कार्य क्षेत्र से 10'9 एम की एकाग्रता के साथ एल्ब्यूमिन के एक उपयुक्त समाधान में ऊष्मायन के बाद प्राप्त किया गया था। इन स्पेक्ट्रा के विश्लेषण ने मानव एल्ब्यूमिन को इसके दो प्रोटियोटाइपिक पेप्टाइड्स द्वारा विश्वसनीय रूप से पहचानना संभव बना दिया। : VPQVSTPTLVEVSR (m / z = 756.5) और YLYEIAR (m / z = 464.3) दोनों पेप्टाइड्स ने अपने दोगुने आवेशित आयनों (MS स्पेक्ट्रा) की अच्छी तरह से उच्चारित चोटियाँ की थीं।

मानव सीरम एल्ब्यूमिन (सी = १० ९ एम) के घोल में इनक्यूबेट की गई एएफएम चिप की रासायनिक रूप से सक्रिय सतह से ट्रिप्सिनाइज्ड वस्तुओं का एमएस / एमएस स्पेक्ट्रा। VPQVSTPTLVEVSR पेप्टाइड एम / जेड = 756.5 (ए) के साथ, YLYEIAR पेप्टाइड एम / जेड = 464.3 (बी) के साथ। प्रायोगिक स्थितियां: माप एक एलसी / एमएसडी ट्रैप एक्ससीटी अल्ट्रा मास स्पेक्ट्रोमीटर (एगिलेंट) पर किए गए थे।

इस प्रकार, एमएस विश्लेषण ने एएफएम द्वारा ज्ञात प्रोटीन की पहचान करना संभव बना दिया। प्राप्त आंकड़ों के आधार पर, AFM चिप की सतह पर पहचाने गए प्रोटियोटाइपिक पेप्टाइड्स की संख्या और विश्लेषण समाधान में वांछित प्रोटीन की सामग्री के बीच एक संबंध का पता चला था। इस तरह की निर्भरता, उदाहरण के लिए, एएफएम चिप की रासायनिक रूप से सक्रिय सतह पर सहसंयोजी रूप से स्थिर P450 VMZ और HSA प्रोटीन के लिए, चित्र 6 में दिखाया गया है। जैसा कि चित्र 6 में देखा जा सकता है, विश्लेषण समाधान में प्रोटीन सांद्रता जितनी अधिक होगी ( -KG6 M), MALDI-MS और ESI-MS विश्लेषण के मामले में पेप्टाइड्स की संख्या जितनी अधिक विश्वसनीय रूप से पहचानना संभव है। विश्लेषण समाधान में विश्लेषण किए गए प्रोटीन के बीच 10 "6-10" 9 एम की एकाग्रता सीमा में पहचाने गए पेप्टाइड्स की संख्या के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था।

ऊष्मायन समाधान में प्रोटीन एकाग्रता पर विश्लेषण अणुओं के पहचाने गए पेप्टाइड्स की संख्या की निर्भरता। (ए) - माल्डी-प्रकार आयनीकरण ब्रूकर माइक्रोफ्लेक्स (ब्रूकर डाल्टनिक्स, जर्मनी) और ऑटोफ्लेक्स III (ब्रूकर डाल्टनिक्स, जर्मनी) के साथ मास स्पेक्ट्रोमीटर पर मॉडल प्रोटीन एचएसए, वीएमजेड के पेप्टाइड्स के मिश्रण का विश्लेषण; (बी) ईएसआई-प्रकार के आयनीकरण एलसी / एमएसडी ट्रैप एक्ससीटी अल्ट्रा (एगिलेंट, यूएसए) के साथ एक मास स्पेक्ट्रोमीटर पर मॉडल प्रोटीन एचएसए, वीएमजेड के पेप्टाइड्स के मिश्रण का विश्लेषण।

प्राप्त परिणामों ने हमें यह निष्कर्ष निकालने की अनुमति दी कि AFM-MS (MALDI और ESI) AFM चिप की सतह पर विश्लेषण समाधान से सहसंयोजक रूप से पकड़े गए प्रोटीन अणुओं को प्रकट करना और पहचानना संभव बनाता है, जो उनके भौतिक रासायनिक गुणों में भिन्न होते हैं।

उसी समय, विश्लेषण समाधान में ऊष्मायन के बाद एएफएम चिप (गैर-सक्रिय) के नियंत्रण क्षेत्र में, एएफएम विधि ने प्रोटीन अणुओं की ऊंचाई के अनुरूप चिप की सतह पर वस्तुओं की उपस्थिति दर्ज नहीं की। एमएस विश्लेषण ने भी प्रोटीन वस्तुओं को प्रकट नहीं किया। इस प्रकार, यह प्रयोगात्मक रूप से साबित हुआ कि एएफएम वांछित वस्तुओं - विश्लेषण के प्रोटीन अणुओं को पर्याप्त रूप से पंजीकृत करता है।

इस कार्य का अगला चरण समाधान से पकड़े गए प्रोटीन की पहचान के लिए एएफएम-एमएस संयोजन योजना का विकास था। जैव विशिष्ट अंतःक्रियाओं का लेखा-जोखा।

मास स्पेक्ट्रोमेट्रिक विश्लेषण करने की योजना - समाधान से प्रोटीन के बायोस्पेसिफिक एएफएम मछली पकड़ने के मामले में, चित्र 7 में दिखाया गया है। उपरोक्त योजना के अनुसार, जांच अणुओं का पहला स्थिरीकरण कार्य क्षेत्र की सतह पर किया गया था। एएफएम चिप्स, जो वायरल हेपेटाइटिस बी और सी के प्रोटीन मार्करों के खिलाफ मोनोक्लोनल 1 एंटीबॉडी थे या एचआईवी -1 ग्लाइकोप्रोटीन जीपीएल 20 और थ्रोम्बिन प्रोटीन के खिलाफ एप्टामर्स थे, जबकि नियंत्रण क्षेत्र की सतह में स्थिर जांच अणु नहीं थे। एजीएम इमेजिंग द्वारा जांच अणुओं के स्थिरीकरण का गुणवत्ता नियंत्रण किया गया था। तब इस तरह की चिप को अध्ययन के तहत प्रोटीन युक्त एक विश्लेषण समाधान में ऊष्मायन किया गया था। चिप की सतह पर गैर-विशिष्ट रूप से सॉर्बेड अणुओं को धोने के चरण के बाद, और एएफएम चिप की सतह पर बाद के मास स्पेक्ट्रोमेट्रिक विश्लेषण के लिए नमूना तैयार करने के चरण के बाद, एएफएम का पता चला प्रोटीन का एमएस विश्लेषण किया गया था।

इस खंड के प्रायोगिक भाग में विश्लेषण के दो चरण शामिल थे। पहले चरण में, एएफएम चिप पर सहसंयोजी रूप से स्थिर प्रोटीन जांच अणुओं की एमएस पहचान करना आवश्यक था, और दूसरे चरण में, बायोस्पेसिफिक इंटरैक्शन के कारण समाधान से या रक्त सीरम के नमूनों से संबंधित भागीदार अणुओं पर पकड़े गए प्रोटीन को लक्षित करें। . इसके लिए, हमने एचसीवी और एचबीवी मार्कर प्रोटीन: एंटी-एचसीवीकोर और एंटी-एचबीवीकोर के खिलाफ सतह पर सहसंयोजक रूप से स्थिर एमसीए एएफएम चिप्स का एमएस विश्लेषण किया। इस काम में पहली बार एंटी-एचसीवीकोर और एंटी-एचबीवीकोर प्रोटीन के खिलाफ एमसीए के लिए, अग्रानुक्रम विखंडन स्पेक्ट्रा और पेप्टाइड मैप स्पेक्ट्रा प्राप्त किए गए थे।

यह पुस्तक प्रोटीन और पेप्टाइड्स के मास स्पेक्ट्रोमेट्री की मूल बातें पर रूसी में पहली पाठ्यपुस्तक है। इस प्रकाशन का उद्देश्य दुनिया भर में युवा शोधकर्ताओं को एक सूचनात्मक, सुंदर और मांग वाले अनुशासन में रुचि देना है, जिससे मौलिक और व्यावहारिक वैज्ञानिक समस्याओं को हल करने के लिए मास स्पेक्ट्रोमेट्री का अधिक प्रभावी ढंग से उपयोग करना संभव हो सके। पुस्तक शुरुआती लोगों के लिए एक व्याख्यान प्रारूप में लिखी गई है, अच्छी तरह से सचित्र है और उद्धृत साहित्य की एक प्रतिनिधि सूची के साथ है।

प्रकाशन रासायनिक, भौतिक-रासायनिक, जैविक और चिकित्सा विशिष्टताओं के स्नातक और स्नातक छात्रों के लिए है; पहले से ही प्रोटीन और पेप्टाइड अनुसंधान के क्षेत्र में काम कर रहे या इस वैज्ञानिक दिशा में रुचि रखने वाले शोधकर्ताओं के लिए उपयोगी होगा।

प्रस्तावना

को समर्पित
रसायन विज्ञान संकाय के प्रोफेसर
मॉस्को स्टेट यूनिवर्सिटी एम.वी. लोमोनोसोव
अलेक्जेंडर लियोनिदोविच कुर्त्ज़
किम पेट्रोविच बुटिन

पिछले 20 वर्षों में मास स्पेक्ट्रोमेट्री की सबसे महत्वपूर्ण उपलब्धियां बायोपॉलिमर सहित प्राकृतिक यौगिकों के अध्ययन से जुड़ी हैं। इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण और मैट्रिक्स-असिस्टेड लेजर डिसोर्शन / आयनीकरण के आगमन के साथ, मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए शर्करा, न्यूक्लिक एसिड, प्रोटीन, लिपिड और अन्य बायोऑर्गेनिक मैक्रोमोलेक्यूल उपलब्ध हो गए हैं। प्रोटीन के अध्ययन में अब तक की सबसे बड़ी प्रगति हुई है। इसकी संवेदनशीलता के कारण, सूचना सामग्री, अभिव्यक्ति, मिश्रण के साथ काम करने की क्षमता, मास स्पेक्ट्रोमेट्री आज इन कठिन वस्तुओं का अध्ययन करने के लिए विश्लेषण करने की मुख्य विधि है।

शायद, यह माना जा सकता है कि आधुनिक मास स्पेक्ट्रोमेट्री ने एडमैन के अनुसार पेप्टाइड्स में अमीनो एसिड के प्राथमिक अनुक्रम को स्थापित करने के लिए शास्त्रीय पद्धति के साथ प्रतियोगिता जीती है, क्योंकि मास स्पेक्ट्रोमेट्रिक अनुक्रमण बहुत तेज, अधिक संवेदनशील, अधिक जानकारीपूर्ण और निकला। और भी सस्ता। प्रोटीन की प्राथमिक संरचना का तेज़ और विश्वसनीय निर्धारण, अर्थात। अमीनो एसिड अनुक्रम पहले से ही अपने आप में एक उत्कृष्ट परिणाम है। हालांकि, मास स्पेक्ट्रोमेट्री अधिक जटिल आदेशों (2 से 4 तक) की संरचनाओं का अध्ययन करने में सक्षम है, जिसमें सुप्रा-प्रोटीन संरचनाओं की उपस्थिति के साथ प्रोटीन के गैर-सहसंयोजक इंटरैक्शन शामिल हैं, पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों के प्रकार और स्थान को स्थापित करते हैं, ग्लाइकोप्रोटीन के साथ काम करते हैं। , लिपोप्रोटीन, फॉस्फोप्रोटीन, आदि। मास स्पेक्ट्रोमेट्री चिकित्सा में अपरिहार्य हो गई है क्योंकि यह हृदय, आनुवंशिक और ऑन्कोलॉजिकल रोगों का शीघ्र और मज़बूती से निदान करने में सक्षम है। यह मास स्पेक्ट्रोमेट्री की सफलताओं के कारण पिछली शताब्दी के अंत में एक नई वैज्ञानिक दिशा - प्रोटिओमिक्स का गठन हुआ। चयापचय में विधि की भूमिका भी बहुत बड़ी है।

दुर्भाग्य से, रूसी भाषा के साहित्य में अभी तक इसके आवेदन में इस सबसे महत्वपूर्ण और बहुआयामी विषय पर पाठ्यपुस्तकें या मोनोग्राफ नहीं हैं। रूस इस अनुशासन के अध्ययन और अपनी उपलब्धियों के उपयोग दोनों में विकसित देशों से मौलिक रूप से पिछड़ रहा है। रूस में काम करने वाले मास स्पेक्ट्रोमेट्रिस्ट को किताबों, मूल लेखों और समीक्षाओं के अंग्रेजी भाषा के संस्करणों पर निर्भर रहना पड़ता है। 2012 में, जे। लास्किन और एच। लाइफशिट्ज़ (अंग्रेजी से अनुवादित, प्रकाशन गृह "टेक्नोस्फीयर") के संपादकीय के तहत "बायोमोलेक्यूल्स पर लागू होने वाले मास स्पेक्ट्रोमेट्री के सिद्धांत" पुस्तक रूसी में प्रकाशित हुई थी, जो प्रमुख द्वारा लेखों का एक संग्रह है। जीव विज्ञान के लिए लागू क्षेत्र मास स्पेक्ट्रोमेट्री में विशेषज्ञ। पुस्तक तैयार पाठकों के लिए डिज़ाइन की गई है। यह प्रदान करता है

एक अच्छा, कई मायनों में, बायोमोलेक्यूल्स के मास स्पेक्ट्रोमेट्री के क्षेत्र में आधुनिक उपलब्धियों से परिचित होने का पत्राचार अवसर, क्योंकि इसमें वर्णित अधिकांश विधियों का अभी तक हमारे देश में उपयोग नहीं किया गया है।

पाठकों को दी जाने वाली पुस्तक "फंडामेंटल्स ऑफ मास स्पेक्ट्रोमेट्री ऑफ प्रोटीन एंड पेप्टाइड्स" रूसी में पहली पाठ्यपुस्तक है, जो प्रोटीन और पेप्टाइड्स के मास स्पेक्ट्रोमेट्री की मूल बातें बताती है। पुस्तक शुरुआती लोगों के लिए व्याख्यान के प्रारूप में लिखी गई है, जिसमें बड़ी संख्या में आंकड़े, स्पेक्ट्रा, आरेख और उद्धृत साहित्य की प्रतिनिधि सूची के साथ सचित्र है। यह रासायनिक, भौतिक-रासायनिक, जैविक और चिकित्सा विशिष्टताओं के स्नातक और स्नातक छात्रों के लिए डिज़ाइन किया गया है; पहले से ही प्रोटीन और पेप्टाइड अनुसंधान के क्षेत्र में काम कर रहे या इस वैज्ञानिक दिशा में रुचि रखने वाले शोधकर्ताओं के लिए उपयोगी होगा।

इस तरह की पुस्तक को प्रकाशित करने का उद्देश्य युवा शोधकर्ताओं को दुनिया भर में एक सूचनात्मक, बहुत सुंदर और लोकप्रिय अनुशासन में रुचि देना है, ताकि वे अपनी मौलिक और व्यावहारिक वैज्ञानिक समस्याओं को हल करने के लिए मास स्पेक्ट्रोमेट्री का अधिक प्रभावी ढंग से उपयोग करने का अवसर प्रदान कर सकें।

पाठ्यपुस्तक में मुख्य ध्यान प्रोटीन और पेप्टाइड्स के आयनीकरण के तरीकों, गैस चरण में इन यौगिकों के विखंडन की प्रक्रियाओं पर दिया जाता है। अग्रानुक्रम मास स्पेक्ट्रोमेट्री के मुद्दों और विखंडन की शुरुआत के मौजूदा तरीकों पर पर्याप्त विस्तार से विचार किया गया है। आधुनिक मास स्पेक्ट्रोमेट्री में यह खंड बहुत महत्वपूर्ण है। यह किसी भी रासायनिक यौगिक और बायोपॉलिमर के साथ काम करने वाले शोधकर्ताओं के लिए उपयोगी है। कई अध्याय प्रोटीन और पेप्टाइड्स की पहचान के लिए समर्पित हैं। इसमें स्वचालित पहचान के विकल्प, स्पेक्ट्रा की मैनुअल डिकोडिंग, मास स्पेक्ट्रोमेट्रिक अनुक्रमण की विशिष्ट जटिलताओं का विवरण और उन पर काबू पाने के विकल्प शामिल हैं। प्रोटीन की रासायनिक संरचना को निर्धारित करने के दो मुख्य तरीकों के फायदे और नुकसान पर विचार किया जाता है: "टॉप-डाउन" और "बॉटम-अप" मास स्पेक्ट्रोमेट्री। मात्रात्मक विश्लेषण के प्रश्नों के लिए एक अलग अध्याय समर्पित है।

पुस्तक अलेक्जेंडर लियोनिदोविच कुर्तज़ और किम पेट्रोविच बुटिन को समर्पित है, दो दोस्त, मॉस्को स्टेट यूनिवर्सिटी के रसायन विज्ञान संकाय के उल्लेखनीय प्रोफेसरों के नाम पर एम.वी. लोमोनोसोव, जो मानवीय दृष्टि से हमारे बहुत करीब हैं, जिन्होंने सीधे हमारी रासायनिक और मानवीय शिक्षा में भाग लिया। हमने हमेशा इन वैज्ञानिकों के रासायनिक ज्ञान और अद्भुत व्यक्तिगत गुणों की सराहना की है। इन लोगों के साथ संचार ने हमें २१वीं सदी की शुरुआत में पेप्टाइड्स के मास स्पेक्ट्रोमेट्री के क्षेत्र में अनुसंधान शुरू करने के लिए प्रेरित किया।

पर। लेबेडेव
के.ए. आर्टेमेंको
टी.यू. समगीना

अलग कर रहा है: क्षार, क्षारीय पृथ्वी धातुओं (सोडियम क्लोराइड, मैग्नीशियम सल्फेट), अमोनियम सल्फेट के लवण के साथ वर्षा; प्रोटीन की प्राथमिक संरचना परेशान नहीं होती है;

अवसादन: निर्जलित पदार्थों का उपयोग: अल्कोहल या एसीटोन कम तापमान (लगभग -20 ) पर।

इन विधियों का उपयोग करते समय, प्रोटीन अपने जलयोजन खोल से वंचित हो जाते हैं और घोल में अवक्षेपित हो जाते हैं।

विकृतीकरण- प्रोटीन की स्थानिक संरचना का उल्लंघन (अणु की प्राथमिक संरचना संरक्षित है)। यह प्रतिवर्ती हो सकता है (डिनाट्यूरिंग एजेंट को हटाने के बाद प्रोटीन संरचना को बहाल किया जाता है) या अपरिवर्तनीय (अणु की स्थानिक संरचना को बहाल नहीं किया जाता है, उदाहरण के लिए, जब प्रोटीन केंद्रित खनिज एसिड, भारी धातु लवण के साथ अवक्षेपित होते हैं)।

प्रोटीन पृथक्करण के तरीके प्रोटीन को कम आणविक भार अशुद्धियों से अलग करना

डायलिसिस

एक विशेष बहुलक झिल्ली का उपयोग किया जाता है, जिसमें एक निश्चित आकार के छिद्र होते हैं। छोटे अणु (कम आणविक भार अशुद्धियाँ) झिल्ली में छिद्रों से गुजरते हैं, जबकि बड़े (प्रोटीन) बने रहते हैं। इस प्रकार, प्रोटीन अशुद्धियों से धोए जाते हैं।

आणविक भार द्वारा प्रोटीन का पृथक्करण

जेल क्रोमैटोग्राफी

क्रोमैटोग्राफिक कॉलम जेल बीड्स (सेफैडेक्स) से भरा होता है, जिसमें एक निश्चित आकार के छिद्र होते हैं। कॉलम में प्रोटीन का मिश्रण डाला जाता है। प्रोटीन, जिसका आकार सेफैडेक्स के रोमछिद्रों के आकार से छोटा होता है, स्तंभ में बनाए रखा जाता है, क्योंकि वे छिद्रों में "फंस जाते हैं", और बाकी स्वतंत्र रूप से स्तंभ छोड़ देते हैं (चित्र। 2.1)। प्रोटीन का आकार उसके आणविक भार पर निर्भर करता है।

चावल। २.१.जेल निस्पंदन द्वारा प्रोटीन का पृथक्करण

ultracentrifugation

यह विधि विभिन्न घनत्व प्रवणताओं (सुक्रोज बफर या सीज़ियम क्लोराइड) (चित्र 2.2) के साथ समाधान में प्रोटीन अणुओं के अवसादन (अवसादन) की विभिन्न दरों पर आधारित है।

चावल। २.२.अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा प्रोटीन का पृथक्करण

वैद्युतकणसंचलन

यह विधि आवेश के आधार पर विद्युत क्षेत्र में प्रोटीन और पेप्टाइड्स के प्रवास की विभिन्न दरों पर आधारित है।

वैद्युतकणसंचलन के वाहक जैल, सेल्यूलोज एसीटेट, अगर हो सकते हैं। अलग किए जाने वाले अणु अपने आकार के आधार पर जेल में चले जाते हैं: उनमें से जो बड़े होते हैं वे जेल के छिद्रों से गुजरते समय बने रहेंगे। छोटे अणु कम प्रतिरोध का सामना करेंगे और इसलिए तेजी से आगे बढ़ेंगे। नतीजतन, वैद्युतकणसंचलन के बाद, छोटे अणुओं की तुलना में बड़े अणु शुरुआत के करीब होंगे (चित्र। 2.3)।

चावल। २.३... जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा प्रोटीन का पृथक्करण

वैद्युतकणसंचलन द्वारा प्रोटीन को आणविक भार द्वारा अलग किया जा सकता है।ऐसा करने के लिए, उपयोग करें पृष्ठ में सोडियम डोडेसिल सल्फेट (DDS-Na) की उपस्थिति में वैद्युतकणसंचलन.

व्यक्तिगत प्रोटीन का अलगाव

एफ़िनिटी क्रोमेटोग्राफ़ी

विधि गैर-सहसंयोजक बंधों द्वारा विभिन्न अणुओं को मजबूती से बांधने के लिए प्रोटीन की क्षमता पर आधारित है। इसका उपयोग एंजाइम, इम्युनोग्लोबुलिन, रिसेप्टर प्रोटीन के अलगाव और शुद्धिकरण के लिए किया जाता है।

पदार्थों के अणु (लिगैंड्स) जिनके साथ कुछ प्रोटीन विशेष रूप से बंधते हैं, सहसंयोजक रूप से एक निष्क्रिय पदार्थ के कणों से जुड़े होते हैं। प्रोटीन के मिश्रण को कॉलम में पेश किया जाता है, और वांछित प्रोटीन मजबूती से लिगैंड से जुड़ा होता है। शेष प्रोटीन स्वतंत्र रूप से स्तंभ छोड़ देते हैं। बनाए रखा प्रोटीन तो एक बफर समाधान के साथ स्तंभ से बाहर धोया जा सकता है जिसमें लिगैंड मुक्त होता है। यह अत्यधिक संवेदनशील विधि सैकड़ों अन्य प्रोटीन युक्त सेल के अर्क से शुद्ध रूप में बहुत कम मात्रा में प्रोटीन को अलग करने की अनुमति देती है।

आइसोइलेक्ट्रिक फोकसिंग

विधि प्रोटीन के आईईपी के विभिन्न मूल्यों पर आधारित है। एम्फ़ोलिन के साथ एक प्लेट पर वैद्युतकणसंचलन द्वारा प्रोटीन को अलग किया जाता है (यह एक ऐसा पदार्थ है जिसमें 3 से 10 की सीमा में पूर्व-निर्मित पीएच ढाल होता है)। वैद्युतकणसंचलन के दौरान, प्रोटीन को उनके IEP के मूल्य के अनुसार अलग किया जाता है (IEP में, प्रोटीन का चार्ज शून्य होगा, और यह विद्युत क्षेत्र में नहीं चलेगा)।

2डी वैद्युतकणसंचलन

यह एसडीएस-ना के साथ आइसोइलेक्ट्रिक फोकसिंग और वैद्युतकणसंचलन का एक संयोजन है। सबसे पहले, वैद्युतकणसंचलन एम्फ़ोलिन के साथ एक प्लेट पर क्षैतिज दिशा में किया जाता है। प्रोटीन को चार्ज (IEP) के अनुसार अलग किया जाता है। फिर प्लेट को एसडीएस-ना घोल से उपचारित किया जाता है और वैद्युतकणसंचलन ऊर्ध्वाधर दिशा में किया जाता है। आणविक भार के आधार पर प्रोटीन को अलग किया जाता है।

इम्यूनोइलेक्ट्रोफोरेसिस (पश्चिमी धब्बा)

एक नमूने में विशिष्ट प्रोटीन को निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल की जाने वाली एक विश्लेषणात्मक विधि (चित्र २.४)।

जैविक सामग्री से प्रोटीन का अलगाव।

एसडीएस-ना के साथ पृष्ठ में वैद्युतकणसंचलन द्वारा आणविक भार द्वारा प्रोटीन का पृथक्करण।

आगे के काम को सुविधाजनक बनाने के लिए जेल से पॉलीमर प्लेट में प्रोटीन का स्थानांतरण।

शेष छिद्रों को भरने के लिए गैर-विशिष्ट प्रोटीन के घोल से प्लेट का उपचार।

इस प्रकार, इस चरण के बाद, एक प्लेट प्राप्त होती है, जिसके छिद्रों में अलग-अलग प्रोटीन होते हैं, और उनके बीच की जगह एक गैर-विशिष्ट प्रोटीन से भर जाती है। अब हमें यह पता लगाने की जरूरत है कि क्या प्रोटीन में वांछित प्रोटीन है जो किसी प्रकार की बीमारी के लिए जिम्मेदार है। पता लगाने के लिए एंटीबॉडी उपचार का उपयोग किया जाता है। प्राथमिक एंटीबॉडी को लक्ष्य प्रोटीन के प्रति एंटीबॉडी का मतलब समझा जाता है। माध्यमिक एंटीबॉडी को प्राथमिक एंटीबॉडी के प्रति एंटीबॉडी का मतलब समझा जाता है। द्वितीयक एंटीबॉडी की संरचना में एक अतिरिक्त विशेष लेबल (तथाकथित आणविक जांच) जोड़ा जाता है, ताकि परिणामों की कल्पना की जा सके। रेडियोधर्मी फॉस्फेट या एक एंजाइम जो एक माध्यमिक एंटीबॉडी से कसकर बंधे होते हैं, एक लेबल के रूप में उपयोग किया जाता है। पहले प्राथमिक और फिर द्वितीयक एंटीबॉडी के लिए बाध्यकारी दो लक्ष्य हैं: विधि का मानकीकरण और परिणामों में सुधार।

प्राथमिक एंटीबॉडी के घोल से उपचार बाइंडिंग प्लेट के उस स्थान पर होती है जहां एंटीजन (टारगेट प्रोटीन) होता है।

अनबाउंड एंटीबॉडी को हटाना (धोना)।

बाद के विकास के लिए लेबल किए गए माध्यमिक एंटीबॉडी के समाधान के साथ उपचार।

अनबाउंड सेकेंडरी एंटीबॉडी (धुलाई) को हटाना।

चावल। २.४... इम्यूनोइलेक्ट्रोफोरेसिस (पश्चिमी धब्बा)

जैविक सामग्री में वांछित प्रोटीन की उपस्थिति के मामले में, प्लेट पर एक पट्टी दिखाई देती है, जो इस प्रोटीन को संबंधित एंटीबॉडी के साथ बांधने का संकेत देती है।

प्रोटीन की पहचान करने के लिए, अनुसंधान टीमों के भीतर विकसित ईएमबीएल और सीक्वेस्ट डेटाबेस में विभिन्न खोज प्रणालियों का उपयोग किया जाता है। हालांकि, मैस्कॉट सर्च इंजन प्रोटीन की पहचान के लिए मानक बन गया है। लगभग सभी खोज इंजनों की तरह, यह एक वेब इंटरफ़ेस का उपयोग करता है और खोज इंजन स्वयं इंटरनेट पर उपलब्ध है, लेकिन इसे उपयोगकर्ता के कंप्यूटर पर भी खरीदा और स्थापित किया जा सकता है।

शुभंकर विभिन्न प्लग करने योग्य प्रोटीन और जीनोमिक डेटाबेस के साथ काम कर सकता है। ये व्यापक सार्वजनिक डेटाबेस हो सकते हैं जैसे एनसीबीआई या स्विसप्रोट, वाणिज्यिक, या उपयोगकर्ता-निर्मित।

सभी प्रणालियों में, प्रोटीन की ज्ञात संरचनाओं के साथ तुलना करके, शोधकर्ता द्वारा प्राप्त मास स्पेक्ट्रोमेट्रिक डेटा के अनुसार पहचान की जाती है।

यह देखते हुए कि हाल के दशकों में, प्रोटीन की अनुक्रमण कम कर दिया गया है, वास्तव में, उन्हें कूटबद्ध करने वाले जीन के अनुक्रमण के लिए, व्यवहार में ज्ञात जीनोम के साथ प्रायोगिक द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्रिक डेटा की तुलना करके प्रोटीन की पहचान करना अधिक उचित है।

प्रोटीन की पहचान के लिए विभिन्न एल्गोरिदम हैं, लेकिन उनकी क्षमताएं वर्तमान में ज्ञात जीनोम द्वारा सीमित हैं। हालांकि, यह देखते हुए कि जीव विभिन्न प्रकारफिर भी, उनके पास समरूप प्रोटीन होते हैं, अज्ञात जीनोम वाले जीवों से प्रोटीन की पहचान करना अक्सर संभव होता है।

प्रोटिओमिक अनुसंधान के लिए विभिन्न पद्धतिगत दृष्टिकोण मौलिक रूप से विभिन्न प्रकार के डेटा देते हैं और प्रसंस्करण के लिए अपने स्वयं के कम्प्यूटेशनल दृष्टिकोण की आवश्यकता होती है।

सबसे सुलभ और अत्यधिक उत्पादक विधि विशिष्ट प्रोटियोलिटिक हाइड्रोलिसिस के मास-स्पेक्ट्रोमेट्रिक पेप्टाइड मानचित्रों द्वारा पहचान की विधि है। अंग्रेजी भाषा के साहित्य में, इसे पेप्टाइड मास फ़िंगरप्रिंट (पीएमएफ) के रूप में जाना जाता है। ट्रिप्सिन को अक्सर एक विशिष्ट प्रोटीज़ के रूप में प्रयोग किया जाता है। पहले चरण में, पृथक प्रोटीन (उदाहरण के लिए, वैद्युतकणसंचलन द्वारा) प्रोटियोलिटिक हाइड्रोलिसिस से गुजरता है। इस हाइड्रोलिसिस के परिणामस्वरूप, पेप्टाइड्स का मिश्रण प्राप्त होता है। यह देखते हुए कि अत्यधिक विशिष्ट प्रोटीज का उपयोग किया जाता है, यह बहुत विशिष्ट पेप्टाइड्स का मिश्रण होगा। इसलिए, ट्रिप्सिन का उपयोग करते समय, प्रोटीन आर्जिनिन और लाइसिन में "कट" जाएगा।

अगला चरण परिणामी मिश्रण के द्रव्यमान स्पेक्ट्रम का पंजीकरण है। परिणाम आणविक भार का एक सेट या सूची है। यह उत्पादों की संरचना या अन्य गुणों के बारे में कोई जानकारी प्रदान नहीं करता है, विधि केवल इस धारणा पर आधारित है कि ये पेप्टाइड्स के आणविक भार हैं, और इन पेप्टाइड्स का गठन विशिष्ट हाइड्रोलिसिस के परिणामस्वरूप हुआ था। यह वह जगह है जहां दृष्टिकोण का मुख्य विचार छिपा हुआ है - यदि प्रत्येक प्रोटीन में पेप्टाइड्स का अपना सेट और आणविक भार की संबंधित सूची होती है, तो उलटा समस्या को हल करना काफी संभव है - परिणामी के लिए संबंधित प्रोटीन को खोजने के लिए आणविक भार की सूची। और ऐसी समस्या वास्तव में अक्सर हल हो जाती है।

विशेष रूप से, यह आपको शुभंकर बनाने की अनुमति देता है।